DieErfindung betrifft Glutaminyl-Cyclase (QC, EC 2.3.2.5), welche dieintramolekulare Cyclisierung von N-terminalen Glutaminresten zuPyroglutaminsäure (5-Oxoprolin, pGlu*) unter Freisetzungvon Ammoniak und die intramolekulare Cyclisierung von N-terminalenGlutamatresten zu Pyroglutaminsäure unter Freisetzung vonWasser katalysiert.
Dievorliegende Erfindung identifiziert Säugetier QCs als Metallenzyme,und stellt neue physiologische Substrate von QC in Säugetierenund die Verwendung von Effektoren der QC und pharmazeutische Zusammensetzungen,die Effektoren der QC enthalten, für die Behandlung vonZuständen, die durch die Modulation der QC Aktivitätbehandelt werden können, bereit. Darüber hinauswird gezeigt, dass Metall-Wechselwirkung ein nützlicherAnsatz für die Entwicklung von QC-Inhibitoren (QC-Hemmern)ist.
Ineiner bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegendeErfindung die Verwendung von Effektoren der QC-Aktivitätin Kombination mit Inhibitoren der DP IV oder DP IV-ähnlichenEnzymen zur Behandlung oder Linderung von Zuständen bereit,die durch die Modulation der QC- und/oder DP IV-Aktivitätbehandelt werden können.
EinScreening-Verfahren für die Ermittlung und Auswahl vonEffektoren der QC-Aktivität wird auch zur Verfügunggestellt.
HintergrundGlutaminyl-Cyclase(QC, EC 2.3.2.5) katalysiert die intramolekulare Cyclisierung vonN-terminalen Glutaminresten zu Pyroglutaminsäure (pGlu*),wobei Ammoniak freigesetzt wird. 1963 wurde QC zum ersten Mal vonMesser aus dem Latex der tropischen Pflanze Carica papaya isoliert(Messer, M. 1963 Nature 4874, 1299). 24 Jahre späterwurde eine entsprechende enzymatische Aktivität in einerTierhypophyse entdeckt (Busby, W. H. J. et al. 1987 J BiolChem 262, 8532-8536; Fischer, W. H. und Spiess,J. 1987 Proc Natl Acad Sci USA 84, 3628-3632). Fürdie Säugetier QC konnte die Umwandlung von Gln zu pGludurch QC für die Vorläufer von TRH und GnRH gezeigtwerden (Busby, W. H. J. et al. 1987 J Biol Chem 262, 8532-8536; Fischer, W.H. und Spiess, J. 1987 Proc Natl Acad Sci USA 84, 3628-3632).Zudem ergaben erste Lokalisierungsversuche für QCin Rinderhypophyseeine Kolokalisation mit seinen mutmaßlichen Katalyseprodukten,wodurch die vorgeschlagene Funktion in der Peptid-Hormon-Syntheseweiter belegt wurde (Rockers, T. M. et al. 1995 J Neuroendocrinol7, 445-453). Im Gegensatz dazu ist die physiologische Funktionder pflanzlichen QC weniger klar. Im Fall des Enzyms aus C. papayawurde eine Rolle bei der pflanzlichen Verteidigung gegen pathogeneMikroorganismen vorgeschlagen (El Moussaoui, A. et al. 2001Cell Mol Life Sci 58, 556-570). Mutmaßliche QCsaus anderen Pflanzen wurden vor kurzem durch Sequenzvergleiche ermittelt(Dahl, S. W. et al. 2000 Protein Expr Purif 20, 27-36).Die physiologische Funktion dieser Enzyme ist jedoch noch immernicht eindeutig bekannt.
Dieaus Pflanzen und Tieren bekannten QCs zeigen eine strikte Spezifitätfür L-Glutamin in der N-terminalen Position der Substrateund es wurde festgestellt, dass ihr kinetisches Verhalten der Michaelis-Menten Gleichunggehorcht (Pohl, T. et al. 1991 Proc Natl Acad Sci USA 88,10059-10063; Consalvo, A. P. et al. 1988 Anal Biochem175, 131-138; Gololobov, M. Y. et al. 1996 BiolChem Hoppe-Seyler 377, 395-398). Ein Vergleich der Primärstrukturender QCs aus C. papaya und der der hochkonservierten QC aus Säugetierenergab jedoch keine Sequenzhomologie (Dahl, S. W. et al.2000 Protein Expr Purif 20, 27-36). Während diepflanzlichen QCs zu einer neuen Enzymfamilie zu gehörenscheinen (Dahl, S. W. et al. 2000 Protein Expr Purif 20,27-36), wurde gefunden, dass die Säugetier QCseine ausgeprägte Sequenzhomologie zu bakteriellen Aminopeptidasenhaben (Bateman, R. C. et al. 2001 Biochemistry 40, 11246-11250),was zu dem Schluss führte, dass die QCs aus Pflanzen undTieren unterschiedliche evolutionäre Ursprüngehaben.
EP 02 011 349.4 offenbartPolynucleotide, die für Insekten Glutaminyl-Cyclase codierensowie Polypeptide, die dadurch codiert sind. Diese Anmeldung stelltferner Wirtszellen bereit, die Expressionsvektoren enthalten, dieerfindungsgemäße Polynucleotide enthalten. IsoliertePolypeptide und Wirtszellen, die Insekten QC enthalten, sind nützlichbei Screening-Verfahren nach Mitteln, die die Aktivitätder Glutaminyl-Cyclase verringern. Solche Mittel werden beschrieben,nützlich als Pestizide zu sein.
Alzheimer-Krankheit(AD) ist durch eine abnorme Akkumulation von extrazellulärenamyloiden Plaques charakterisiert, die eng mit dystrophischen Neuronen,reaktiven Astrozyten und Mikroglia assoziiert sind (Terry,R. D. und Katzman, R. 1983 Ann Neurol 14, 497-506; Glenner,G. G. und Wong, C. W. 1984 Biochem Biophys Res Comm 120, 885-890; Intagaki,S. et al. 1989 J Neuroimmunol 24, 173-182; Funato,H. et al. 1998 Am J Pathol 152, 983-992; Selkoe,D. J. 2001 Physiol Rev 81, 741-766). Amyloid-beta (Aβ)Peptide sind die hauptsächlichen Bestandteile der senilenPlaques und es wird angenommen, dass sie unmittelbar an der Pathogeneseund Progression von AD beteiligt sind, eine Hypothese, die durchgenetische Studien gestützt wird (Glenner, G. G.und Wong, C. W. 1984 Biochem Biophys Res Comm 120, 885-890; Borchelt,D. R. et al. 1996 Neuron 17, 1005-1013; Lemere,C. A. et al. 1996 Nat Med 2, 1146-1150; Mann, D.M. und Iwatsubo, T. 1996 Neurodegeneration 5, 115-120; Citron,M. et al. 1997 Nat Med 3, 67-72; Selkoe, D. J.2001 Physiol Rev 81, 741-766). Aβ wird durch proteolytischeProzessierung des β-Amyloid-Vorläuferproteins(APP) generiert (Kang, J. et al. 1987 Nature 325, 733-736; Selkoe,D. J. 1998 Trends Cell Biol 8, 447-453), das sequenziell gespaltenwird durch β-Sekretase am N-Terminus und γ-Sekretaseam C-Terminus von Aβ (Haass, C. und Selkoe, D.J. 1993 Cell 75, 1039-1042; Simons, M. et al. 1996J Neurosci 16, 899-908). Zusätzlich zu den dominantenAβ Peptiden, die mit L-Asp am N-Terminus beginnen (Aβ1-42/40),tritt eine große Heterogenität von N-terminalverkürzten Formen bei senilen Plaques auf. Von diesen verkürztenPeptiden wird berichtet, dass sie in-vitro neurotoxischer sind undschneller als die vollständigen Isoformen aggregieren (Pike,C. J. et al. 1995 J Biol Chem 270, 23895-23898). Es istbekannt, dass N-verkürzte Peptide in Subjekten mit familiärem AD(FAD) in einem frühen Stadium überproduziert werden(Saido, T. C. et al. 1995 Neuron 14, 457-466; Russo, C.et al. 2000 Nature 405, 531-532), früh im Gehirnbei Down-Syndrom (DS) auftreten und sich mit dem Alter anreichern(Russo, C. et al. 1997 FEBS Lett 409, 411-416; Russo,C. et al. 2001 Neurobiol Dis 8, 173-180; Tekirian,T. L. et al. 1998 J Neuropathol Exp Neurol 57, 76-94).Schließlich gibt deren Menge die fortschreitende Schwereder Erkrankung wieder (Russo, C. et al. 1997 FEBS Lett 409,411-416). Zusätzlich können post-translationaleProzesse den N-Terminus weiter modifizieren, durch Isomerisierungoder Racemisierung des Aspartats bei Position 1 und 7 und durchCyclisierung von Glutamat bei den Resten 3 und 11. Pyroglutamat-haltige Isoformenbei Position 3 [pGlu3] Aβ3-40/42]stellen die wichtigen Formen – ca. 50% der gesamten Aβ Menge – derN-verkürzten Arten bei senilen Plaques dar (Mori,H. et al. 1992 J Biol Chem 267, 17082-17086, Saido, T.C. et al. 1995 Neuron 14, 457-466; Russo, C. etal. 1997 FEBS Lett 409, 411-416; Tekirian, T. L.et al. 1998 J Neuropathol Exp Neurol 57, 76-94; Geddes,J. W. et al. 1999 Neurobiol Aging 20, 75-79; Harigaya,Y. et al. 2000 Biochem Biophys Res Commun 276, 422-427)und sie sind auch bei prä-amyloiden Läsionen vorhanden (Lalowski,M. et al. 1996 J Biol Chem 271, 33623-33631). Die Anhäufungvon AβN3(pE) Peptiden erfolgt vermutlich aufgrund der strukturellen Änderung,die die Aggregation verstärkt und Resistenz gegenüberden meisten Aminopeptidasen verleiht (Saido, T. C. et al.1995 Neuron 14, 457-466; Tekirian, T. L. et al.1999 J Neurochem 73, 1584-1589). Dieser Nachweis gibt Hinweisefür eine zentrale Rolle der AβN3(pE) Peptide beider AD Pathogenese. Allerdings ist relativ wenig über ihreNeurotoxizität und Aggregationseigenschaften bekannt (He, W.und Barrow, C. J. 1999 Biochemistry 38, 10871-10877; Tekirian,T. L. et al. 1999 J Neurochem 73, 1584-1589). Darüberhinaus sind die Wirkung dieser Isoformen auf Gliazellen und dieAntwort der Gliazellen auf diese Peptide völlig unbekannt,obwohl aktivierte Gliazellen strikt mit senilen Plaques assoziiertsind und aktiv zu der Anhäufung von Amyloid-Ablagerungenbeitragen könnten. In neueren Studien wurden die Toxizität,Aggregationseigenschaften und der Katabolismus von Aβ1-42,Aβ1-40, [pGlu3]Aβ3-42und [pGlu3]Aβ3-40 Peptiden in Kulturenvon neuronalen und Gliazellen untersucht, und es wurde gezeigt,dass eine Änderung von Pyroglutamat die toxischen Eigenschaftender Aβ Peptide verschlimmert und auch deren Abbau durchkultivierte Astrozyten hemmt. Shirotani et al. untersuchtendie Entstehung von [pGlu3]Aβ Peptidenin primären kortikalen Neuronen, die in vitro mit Sindbis-Virusinfiziert waren. Sie konstruierten zu Amyloid-Vorläuferprotein komplementäreDNAs, die durch Aminosäure-Substitution und -Deletion füreinen potentiellen Vorläufer von [pGlu3]Aβ codierten.Für einen künstlichen Vorläufer, dermit einem N-terminalen Glutaminrest an Stelle von Glutamat in demnatürlichen Vorläufer beginnt, wurde eine spontaneUmwandlung oder eine enzymatische Umwandlung durch Glutaminyl-Cyclasezu Pyroglutamat vorgeschlagen. Der Cyclisierungsmechanismus des N-terminalenGlutamats bei Position 3 in dem natürlichen Vorläufervon [pGlu3]Aβ wurde in vivo nichtbestimmt (Shirotani, K., Tsubuki, S., Lee, H. J., Maruyama,K., und Saido, T. C. (2002) Neurosci Lett 327, 25-28).
DipeptidylpeptidaseIV (DP IV) ist eine post-Prolin (zu einem geringeren Umfang einepost-Alanin, post-Serin oder post-Glycin) spaltende Serinprotease,die in verschiedenen Geweben des Körpers gefunden wird,einschließlich Niere, Leber und Darm, und N-terminale Dipeptideaus einer Peptidkette spaltet. Vor kurzem wurde gezeigt, dass DPIV eine wichtige Rolle im Neuropeptid Stoffwechsel, bei der T-Zellaktivierung,der Bindung von Krebszellen an das Endothel und der Aufnahme vonHIV in Lymphzellen spielt. Siehe hierzu WO 02/34242, WO 02/34243, WO 03/002595 und WO 03/002596.
Esist bekannt, dass DP IV-Inhibitoren für die Behandlungder pathologischen Glucosetoleranz und von Diabetes mellitus nützlichsein können (Internationale Patentanmeldung, Publikationsnummer WO 99/61431, Pederson,R. A. et al. 1998 Diabetes 47, 1253-1258 und Pauly,R. P. et al. 1999 Metabolism 48, 385-389). Insbesondereoffenbart WO 99/61431 DPIV-Inhibitoren, umfassend einen Aminosäurerest und eine Thiazolidin-oder Pyrrolidingruppe und Salze derselben, insbesondere L-threo-IsoleucylThiazolidin, L-allo-Isoleucyl Thiazolidin, L-threo-Isoleucyl Pyrrolidin,L-allo-Isoleucyl Thiazolidin, L-allo-Isoleucyl Pyrrolidin, und Salzederselben.
WeitereBeispiele für niedermolekulare Dipeptidylpeptidase IV-Inhibitorensind Mittel, wie z. B. Tetrahydroisoquinolin-3-carboxamid-Derivate,N-substituierte 2-Cyanopyrrole und -pyrrolidine, N-(N\'-substituierte Glycyl)-2-cyanopyrrolidine,N-(substituierte Glycyl)-Thiazolidine, N-(substituierte Glycyl)-4-cyanothiazolidine, Aminoacyl-borono-prolyl-Inhibitoren,Cyclopropyl-fusionierte Pyrrolidine und heterocyclische Verbindungen. Inhibitorender Dipeptidylpeptidase IV sind beschrieben in US 6,380,398; US 6,011,155; US 6,107,317; US 6,110,949; US 6,124,305; US 6,172,081; WO 95/15309; WO 99/61431, WO 99/67278, WO 99/67279, DE 198 34 591, WO 97/40832, DE 196 16 486 C2, WO 98/19998, WO 00/07617, WO 99/38501, WO 99/46272, WO 99/38501, WO 01/68603, WO 01/40180, WO 01/81337, WO 01/81304, WO 01/55105, WO 02/02560 und WO 02/14271, WO 02/04610, WO 02/051836, WO 02/068420, WO 02/076450, WO 02/083128, WO 02/38541, WO 03/000180, WO 03/000181, WO 03/000250, WO 03/002530, WO 03/002531, WO 03/002553, WO 03/002593, WO 03/004496, WO 03/024942 und WO 03/024965, deren Lehren hierindurch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen sind, insbesondereim Hinblick auf diese Inhibitoren, ihre Definition, Verwendungenund ihre Herstellung.
Zusammenfassung der ErfindungDievorliegende Erfindung stellt neue physiologische Substrate der QCin Säugetieren, Aβ3-40/42, [Gln3]Aβ3-40/42,[Glu11]Aβ11-40/42, [Gln11]Aβ11-40/42, [Gln1]Gastrin,[Gln1]Neurotensin, [Gln1]FPP, [Gln1]CCL2, [Gln1]CCL7,[Gln1]CCL8, [Gln1]CCL16,[Gln1]CCL18, [Gln1]Fractalkin,[Gln1]Orexin A, [Gln3]glucagon3-29und [Gln5]Substanz P5-11 und die Verwendungvon Effektoren der QC und pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassendEffektoren der QC, für die Behandlung von Zuständen,die durch die Modulation der QC Aktivität behandelt werdenkönnen.
InInhibitionsuntersuchungen wurde gezeigt, dass humane QC eine Metall-abhängigeTransferase ist. QC Apoenzym ließ sich am wirksamsten durchZinkionen reaktivieren, und das Metall-bindende Motiv der Zink-abhängigenAminopeptidasen ist auch in humaner QC vorhanden. Verbindungen,die mit dem im aktiven Zentrum gebundenen Metall interagieren sindhochwirksame Inhibitoren.
Unerwartetwurde gezeigt, dass rekombinante humane QC sowie QC Aktivitätaus Hirnextrakten sowohl die N-terminale Glutaminyl- als auch Glutamat-Cyclisierungkatalysieren. Am auffallendsten ist die Feststellung, dass die Cyclase-katalysierteGlu1-Umlagerung bei etwa pH 6,0 begünstigtist, während die Gln1-Umlagerungzu pGlu-Derivaten bei einem pH-Optimum von etwa 8,0 erfolgt. Dadie Bildung von pGlu-Aβ-verwandten Peptiden durch Hemmungder rekombinanten humanen QC und QC Aktivitäten aus Extraktenvon Schweinehypophyse unterdrückt werden kamen, ist dasEnzym QC ein Ziel in der Medikamentenentwicklung zur Behandlungder Alzheimer-Krankheit.
Durchdie Gabe von Effektoren der QC-Aktivität an ein Säugetierkann es möglich sein, Zustände zu verhindern oderzu lindern, die ausgewählt sind aus: Alzheimer-Krankheit,Down-Syndrom, Magengeschwüren und Magenkrebs mit oder ohneHelicobacter pylori Infektionen, pathogene psychotische Zustände,Schizophrenie, Unfruchtbarkeit, Neoplasie, inflammatorische Reaktionendes Wirts, Krebs, Schuppenflechte, rheumatoide Arthritis, Arteriosklerose,beeinträchtigte humorale und Zell-vermittelte Immunantworten,Leukozyten-Adhäsion- und Migrationsprozesse im Endothel,eingeschränkte Nahrungsaufnahme, Schlaf-Wachsamkeit, beeinträchtigtehomöostatische Regulation des Energiestoffwechsels, beeinträchtigteautonome Funktion, beeinträchtigte hormonale Balance undbeeinträchtigte Regulierung der Körperflüssigkeiten.
Fernerkann es durch die Gabe von Effektoren der QC-Aktivitätan ein Säugetier möglich sein, die Zellproliferationdes Magen-Darm Traktes anzuregen, vorzugsweise die Proliferationvon Zellen der Magenschleimhaut, Epithelzellen, die akute Säuresekretionund die Differenzierung der Säure produzierenden Belegzellenund Histamin-sekretierende enterochromaffine Zellen.
Weiterhinkann es durch die Verabreichung von Effektoren der QC-Aktivitätan ein Säugetier möglich sein, die Proliferationvon myeloischen Vorläuferzellen zu unterdrücken.
Darüberhinaus kann die Verabreichung von QC Inhibitoren zur Unterdrückungder männlichen Fruchtbarkeit führen:
In einerbevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindungdie Verwendung von Effektoren der QC-Aktivität in Kombinationmit Inhibitoren der DP IV oder DP IV-ähnlichen Enzymenfür die Behandlung oder Linderung von Zuständenbereit, die durch die Modulation der QC und/oder DP IV Aktivitätbehandelt werden können.
Dievorliegende Erfindung stellt pharmazeutische Zusammensetzungen fürdie parenterale, enterale oder orale Verabreichung bereit, umfassendmindestens einen Effektor der QC, optional in Kombination mit üblichenTräger- und/oder Hilfsstoffen; oder umfassend mindestenseinen Effektor der QC in Kombination mit mindestens einem DP IV-Inhibitor,optional in Kombination mit üblichen Träger- und/oderHilfsstoffen.
Screening-Verfahrenfür die Ermittlung und Auswahl von Effektoren der QC werdenauch bereit gestellt.
Kurze Beschreibung der ZeichnungenWeitereErkenntnisse über diese und andere Aspekte der vorliegendenErfindung werden unter Einbeziehung der Figuren erhalten, wobei:
1 zeigtdie Verlaufskurven der Cyclisierung von H-Gln-Ala-OH, katalysiertdurch humane QC, wobei die Abnahme der Absorption bei 340 nm beobachtetwird. Die Proben enthielten 0,3 mM NADH/H+,14 mM α-Ketoglutarsäure, 30 U/ml Glutamat-Dehydrogenaseund 1 mM H-Gln-Ala-OH. Von Kurve A–D wurden unterschiedlicheKonzentrationen von QC eingesetzt: A, 10 mU/ml, B, 5 mU/ml, C, 2,5mU/ml. Bei der Kurve D wurde QC weggelassen. Eine lineare Beziehungzwischen der QC Konzentration und der beobachteten Aktivität wurdeerhalten (eingefügter Graph).
2 zeigtdie pH-Abhängigkeit von humaner und Papaya (eingefügterGraph) QC, bestimmt unter Geschwindigkeitsbedingungen 1. Ordnungunter Verwendung von Gln-βNA als Substrat. Im Falle derhumanen QC wurde ein Puffersystem verwendet, dass eine konstanteIonenstärke gemäß Ellis und Morrisonbereit stellt, bestehend aus 25 mM MES, 25 mM Essigsäureund 50 mM Tris (Ellis, K. J. und Morrison, J. F. 1982 MethodsEnzymol. 87, 405-426). Aufgrund einer leicht hemmendenWirkung von Tris, wurde Papaya QC unter Verwendung von einem 50mM MOPS Puffer untersucht. Die Ionenstärke wurde durchZugabe von NaCl auf 0,05 M eingestellt. Die Geschwindigkeitsprofilewurden ausgewertet, indem sie an ein Modell angepasst wurden, dasauf Abgangsgruppen basiert. Im Falle von Papaya QC wurde ein PKa von 7,13 ± 0,03 durch Anpassungder Daten an ein einzelnes Dissoziationsmodell erhalten.
3 zeigtdie Wirkung des pH-Wertes auf die Stabilität der QC ausPapaya Latex und humaner QC. Eine Enzymstammlösung wurde20-fach verdünnt in 0,1 M Puffer verschiedener pH-Werte(pH 4–7 Natriumcitrat, pH 7–10 Natriumphosphat).Enzym-Lösungen wurden bei 30°C für 30min inkubiert und anschließend wurde die enzymatische Aktivitätgemäß dem Standard-Protokoll analysiert.
4 zeigtden Vergleich der Spezifitätskonstanten kcat/KM für eine Reihe von Substraten,die Glutamat an der zweiten Aminosäureposition enthalten.Während eine Erhöhung der Spezifitätbei der humanen QC von den Di- zu den Tetrapeptiden detektiert wurde,wurde im Falle der Papaya QC keine Veränderung beobachtet.Die hier präsentierten Daten sind eine Wiederholung dergraphischen Darstellung der in Tabelle 3 angegebenen Parameter.
5 zeigtdie Bildung von pGlu-Lys (pGlu)-Arg-Ala-Leu-NH2 ausH-Gln-Lys (Gln)-Arg-Ala-Leu-NH2, katalysiertdurch die humane QC. Die Substratumwandlung wird beobachtet durchdie zeitabhängige Änderung des m/z-Verhältnissesaufgrund des Austretens von Ammoniak. Die Zusammensetzung der Probewar: 0,5 mM Substrat, 38 nM QC in 40 mM Tris/HCl, pH 7,7. Bei den angegebenenZeiten wurden Proben aus dem Assay-Reagenzglas entnommen, mit derMatrix-Lösung (1:1 V/V) gemischt und anschließenddie Massenspektren aufgenommen. Eine sehr ähnliche Abhängigkeitwurde im Falle der Papaya QC beobachtet.
6 zeigtdie Bildung von pGlu-Phe-Lys-Ala-Glu-NH2 ausH-Gln(NMe)-Phe-Lys-Ala-Glu-NH2, katalysiertdurch Papaya QC. Die Substratumwandlung wird beobachtet durch diezeitabhängige Änderung des m/z-Verhältnissesaufgrund des Austretens von Methylamin. Die Zusammensetzung derProbe war: 0,5 mM Substrat, 0,65 μM Papaya QC in 40 mMTris/HCl, pH 7,7. Bei den angegebenen Zeiten wurden Proben aus demAssay-Reagenzglas entnommen, mit der Matrix-Losung (1:1 V/V) gemischtund anschließend die Massenspektren aufgenommen. KeineSubstratumwandlung wurde in Proben ohne Papaya QC oder bei Anwendungvon bis zu 1,5 μM humaner QC auf das Substrat beobachtet(nicht gezeigt).
7 zeigtdie Bildung von [Gln3]-Aβ3-11 aus[Gln3]Aβ1-11, katalysiert durchDP IV. Bei den angegebenen Zeiten wurden Proben aus dem Assay-Reagenzglasentnommen, mit Matrix-Lösung (1:1 V/V) gemischt und anschließenddie Massenspektren aufgenommen.
8 zeigtdie Verhinderung der Spaltung von [Gln3]Aβ1-11durch den DP IV-Inhibitor Val-Pyrrolidid (Val-Pyrr). Bei den angegebenenZeiten wurden Proben aus dem Assay-Reagenzglas entnommen, mit Matrix-Lösung(1:1 V/V) gemischt und anschließend die Massenspektrenaufgenommen.
9 zeigtdie Bildung von [pGlu3]Aβ3-11 aus[Gln3]Aβ3-11, katalysiert durchQC. Bei den angegebenen Zeiten wurden Proben aus dem Assay-Reagenzglasentnommen, mit Matrix-Lösung (1:1 V/V) gemischt und anschließenddie Massenspektren aufgenommen.
10 zeigtdie Hemmung der Bildung von [pGlu3]Aβ3-11aus [Gln3]Aβ3-11 durch den QC-Inhibitor 1,10-Phenanthrolin.Bei den angegebenen Zeiten wurden Proben aus dem Assay-Reagenzglasentnommen, mit Matrix-Lösung (1:1 V/V) gemischt und anschließenddie Massenspektren aufgenommen.
11 zeigtdie Bildung von [pGlu3]Aβ3-11 aus[Gln3]Aβ1-11 nach aufeinander folgenderKatalyse durch DP IV und QC. Bei den angegebenen Zeiten wurden Probenaus dem Assay-Reagenzglas entnommen, mit Matrix-Lösung(1:1 V/V) gemischt und anschließend die Massenspektrenaufgenommen.
12 zeigtdie Hemmung der Bildung von [pGlu3]Aβ3-11aus [Gln3]Aβ1-11 durch den QC-Inhibitor 1,10-Phenanthrolinin Gegenwart von katalytisch aktiver DP IV und QC. Bei den angegebenenZeiten wurden Proben aus dem Assay-Reagenzglas entnommen, mit Matrix-Lösung(1:1 V/V) gemischt und anschließend die Massenspektrenaufgenommen.
13 zeigtdie Reduktion der Bildung von [pGlu3]Aβ3-11aus [Gln3]Aβ1-11 durch den DP IV-Inhibitor Val-Pyrrin Gegenwart von katalytisch aktiver DP IV und QC. Bei den angegebenenZeiten wurden Proben aus der Assay-Mischung entnommen, mit Matrix-Lösung(1:1 V/V) gemischt und anschließend die Massenspektrenaufgenommen.
14 zeigtdie Bildung von Peptid [pGlu3]Aβ-3-11aus [Gln3]Aβ1-11 nach aufeinanderfolgender Katalyse durch Aminopeptidase(n) und QC, die in Schweine-Hypophysen-Homogenatvorhanden sind. Bei den angegebenen Zeiten wurden Proben aus demAssay-Reagenzglas entnommen, mit Matrix-Lösung (1:1 V/V) gemischtund anschließend die Massenspektren aufgenommen.
15A und B zeigen Massenspektren von Aβ3-11aund Aβ3-21a, inkubiert mit rekombinanter humaner QC, dievor ihrer Verwendung für 10 Minuten gekocht wurde. C undD zeigen Massenspektren von Aβ3-11 und Aβ3-21ain Gegenwart von aktiver humaner QC, was zur Bildung von [pGlu3]Aβ3-11a bzw. [pGlu3]Aβ3-21a führte.E und F zeigen Massenspektren von Aβ3-11a und Aβ3-21ain Gegenwart von aktiver QC und 5 mM Benzimidazol, das die Bildungvon [pGlu3] unterdrückt.
16 zeigtdie Reaktionsgeschwindigkeiten der von Papaya QC-katalysierten Glu-βNA-Umwandlung,aufgetragen gegen die Substratkonzentration. Die Anfangsgeschwindigkeitenwurden gemessen in 0,1 M Pyrophosphatpuffer, pH 6,1 (Quadrate),0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,5 (Kreise) und 0,1 M Boratpuffer, pH 8,5(Dreiecke). Die kinetischen Parameter lauten wie folgt: KM = 1,13 ± 0,07 mM, kcat =1,13 ± 0,04 min–1 (pH 6,1);KM = 1,45 ± 0,03 mM, kcat =0,92 ± 0,01 mm–1 (pH 7,5);KM = 1,76 ± 0,06 mM, kcat =0,56 ± 0,01 min–1 (pH 8,5).
17 zeigtdie pH-Abhängigkeit der Umwandlung von Gln-βNA(Kreise) und Glu-βNA (Quadrate), bestimmt unter Geschwindigkeitsbedingungen1. Ordnung (S KM).Die Substratkonzentration war 0,01 mM bzw. 0.25 mM. Fürbeide Bestimmungen wurde ein Puffersystem aus drei Komponenten eingesetzt,bestehend aus 0,05 M Essigsäure, 0,05 M Pyrophosphorsäureund 0,05 M Tricin. Alle Puffer wurden durch Zugabe von NaCl aufgleiche Leitfähigkeit eingestellt, um Unterschiede in derIonenstärke zu vermeiden. Die Daten wurden an Gleichungenangepasst, die für zwei Abgangsgruppen gelten und ergabenpKa-Werte von 6,91 ± 0,02 und 9,5 ± 0,1für Gln-βNA und 4,6 ± 0,1 und 7,55 ± 0,02für Glu-βNA. Die pKa-Werteder jeweiligen Substrat-Aminogruppen, bestimmt durch Titration,betrugen 6,97 ± 0,01 (Gln-βNA) und 7,57 ± 0,05(Glu-βNA). Alle Bestimmungen wurden bei 30°C durchgeführt.
18 zeigtdie Verlaufskurven der durch humane QC-katalysierten Cyclisierungvon H-Gln-AMC in Gegenwart von Imidazol, Dipicolinsäureund in Abwesenheit einer hemmenden Verbindung. Die hyperbolische Formder Kurve in Gegenwart von Dipicolinsäure weist auf dieEntfernung von Metallionen aus dem aktiven Zentrum von QC hin.
19 zeigtdie zeitabhängige Inaktivierung von QC durch den heterocyclischenChelatbildner 1,10-Phenanthrolin. Nach der Inkubation des QC-Enzymsmit dem Inhibitor in Abwesenheit von Substrat (durchgezogene Linie),wurde eine Verringerung der enzymatischen Aktivität imVergleich zu Proben beobachtet, die nicht mit Inhibitor vorinkubiertwurden (gestrichelte Linie), was auf die Entfernung von Metallionenaus dem aktiven Zentrum der QC hinweist.
20 zeigtdie Reaktivierung von humaner QC mit einwertigen und zweiwertigenMetallionen. QC wurde durch Zugabe von 2 mM Dipicolinsäurein 50 mM Bis-Tris, pH 6,8 inaktiviert. Anschließend wurdedas Enzym einer Dialyse gegen 50 mM Bis-Tris, pH 6,8, enthaltend1,0 mM EDTA, unterzogen. Reaktivierung der Enzyme wurde durch Inkubationder inaktivierten Enzymprobe mit Metallionen bei einer Konzentrationvon 0,5 mM erreicht, in Gegenwart von 0,5 mM EDTA, um eine unspezifischeReaktivierung durch in Spuren in den Pufferlösungen vorhandeneMetallionen zu vermeiden. Kontrollen werden durch Enzymproben erhalten,die nicht inaktiviert wurden, aber auch gegen EDTA-Lösungdialysiert wurden, wie das inaktivierte Enzym (+EDTA) und Enzymproben,die gegen Pufferlösungen ohne zugesetztes EDTA (–EDTA)dialysiert wurden.
21 Sequenzanordnung(sequence alignment) der humanen QC (hQC) und anderer M28 Familienmitgliederder Metallopeptidase Clan MH. Die Anordnung mehrer Seuqenzen (multiplesequence alignment) erfolgte mit ClustalW bei ch.EMBnet.org mitStandardeinstellungen. Die Konservierung der das Zink-Ion bindendenReste ist gezeigt für humane QC (hQC; GenBank X71125),der Zn-abhängigen Aminopeptidase aus Streptomyces griseus(SGAP; Swiss-Prot P80561), und innerhalb der N-acetylierten-alpha-verbundenensauren Dipeptidase (NAALADase 1) Domäne (Reste 274–587)der humanen Glutamat-Carboxypeptidase II (hGCP II, Swiss-Prot Q04609).Die an der Metallbindung beteiligten Aminosäuren sind fettgedruckt und unterstrichen. Im Falle der humanen QC sind diese Restedie mutmaßlichen Entsprechungen zu den Peptidasen.
Peptid-SequenzenDiehierin erwähnten und verwendeten Peptide haben die folgendenSequenzen:
Dievorliegende Erfindung stellt Effektoren der Glutaminyl-Cyclase (QC)bereit für a) die Behandlung von Krankheitenbei Säugetieren, die durch die Modulation der QC Aktivitätin vivo behandelt werden können und/oderb) die Modulation von physiologischen Prozessen auf der Grundlageder Wirkung von pGlu-enthaltenden Peptiden, verursacht durch Modulationder QC Aktivität.
Darüberhinaus stellt die vorliegende Erfindung Verbindungen zur Hemmungder Glutaminyl-Cyclase (QC, EC 2.3.2.5) und/oder QC-ähnlicherEnzyme in einem Säugetier bereit und die Verwendung vonInhibitoren der QC Aktivität für die Behandlungvon pathologischen Zuständen, die mit QC Aktivitätim Zusammenhang stehen.
Dievorliegende Erfindung stellt auch ein neues Verfahren zur Behandlungder Alzheimer-Krankheit und des Down-Syndroms bereit. Die N-Terminivon Amyloid-beta Peptiden, die bei der Alzheimer-Krankheit und beiDown-Syndrom im Gehirn abgelagert sind, tragen Pyroglutaminsäure.Die Bildung von pGlu ist ein wichtiges Ereignis in der Entwicklungund der Progression der Krankheit, da die modifizierten amyloiden β-Peptideeine erhöhte Neigung zur Aggregation von Amyloid-beta undToxizität zeigen, was wahrscheinlich den Ausbruch und dieProgression der Krankheit verschlechtert. (Russo, C. etal. 2002 J Neurochem 82, 1480-1489).
ImGegensatz dazu ist in den natürlichen Aβ Peptiden(3-40/42) Glutaminsäure als N-terminale Aminosäurevorhanden. Bisher ist keine enzymatische Umwandlung von Glu zu pGlubekannt. Darüber hinaus ist bisher noch keine spontaneCyclisierung von Glu-Peptiden zu pGlu-Peptiden beobachtet worden.Daher war ein Aspekt der vorliegenden Erfindung, die Rolle von QCbei der Alzheimer-Krankheit und Down-Syndrom zu bestimmen. Mit diesemAspekt wurde sich befasst durch die Synthese von Aβ3-11und Aβ1-11, die die Aminosäure Glutamin an Stellevon Glutaminsäure an Position 3 enthalten, die Bestimmungder Substrateigenschaften dieser modifizierten Amyloid-beta Peptidegegenüber QC, DP IV und DP IV-ähnlichen Enzymenund Aminopeptidasen und die Verwendung von Inhibitoren der QC, umdie Bildung von pGlu aus einem N-terminalen Glutaminylrest der Amyloid-betaabgeleiteten Peptide (amyloid β-derived peptides) 1-11und 3-11 zu verhindern. Die Ergebnisse sind in Beispiel 8 gezeigt.Das verwendete Verfahren wird in Beispiel 3 beschrieben.
Bisheute gibt es keine Hinweise, die eine Beteiligung der QC bei derProgression der Krankheit anzeigen, weil Glutaminsäuredie N-terminale Aminosäure in Aβ (3-40/42 oder11-40/42) ist. Aber QC ist das einzige bekannte Enzym, das fähigist, pGlu am N-Terminus von Peptiden zu bilden. Weitere Aspekteder vorliegenden Erfindung betreffen die folgenden Erkenntnisseund Entdeckungen: a) In einer Nebenreaktionkatalysiert QC die Cyclisierung von Glutaminsäure zu Pyroglutaminsäuremit sehr niedriger Geschwindigkeit,b) Glutaminsäure aus APP oder dessen anschließendgebildeten Amyloid-beta Peptiden wird post-translational durch eineunbekannte enzymatische Aktivität in Glutamin umgewandeltund in einem zweiten Schritt katalysiert QC die Cyclisierung vonGlutamin zu Pyroglutaminsäure nach der Prozessierung desN-Terminus des Amyloid-beta Peptids,c) Glutaminsäure wird post-translational durch einechemische Katalyse oder Autokatalyse in Glutamin umgewandelt undanschließend katalysiert QC die Cyclisierung von Glutaminzu Pyroglutaminsäure nach der Prozessierung des N-Terminusdes Amyloid-beta Peptids,d) im APP-Gen, das für das Amyloid-beta Protein codiert,gibt es Mutationen, die zu Gln statt Glu an Position 3 führen.Nach der Translation und Prozessierung des N-Terminus katalysiertQC die Cyclisierung von Glutamin zu Pyroglutaminsäure,e) Glutamin wird in die entstehende Peptidkette von APP eingearbeitet,aufgrund einer Fehlfunktion einer unbekannten enzymatischen Aktivitätund anschließend katalysiert QC die Cyclisierung des N-terminalen Glutaminszu Pyroglutaminsäure nach der Prozessierung des N-Terminusdes Amyloid-beta Peptids.
QCist in allen fünf oben aufgeführten Fällenam kritischen Schritt beteiligt, nämlich der Bildung von Pyroglutaminsäure,die die Aggregation von Amyloid-beta Peptiden begünstigt.So führt eine Hemmung der QC zu einer Verhinderung derPräzipitation der Plaquebildner Aβ3-40/41/43 oderAβ11-40/41/43, die den Ausbruch und die Progression derAlzheimer-Krankheit und des Down-Syndroms verursachen, unabhängigvom Mechanismus durch den Cyclisierung erfolgt.
Glutamatwird an den Positionen 3, 11 und 22 des Amyloid-beta Peptids gefunden.Unter diesen ist die Mutation von Glutaminsäure (E) zuGlutamin (Q) an Position 22 (entsprechend zu dem Amyloid-VorläuferproteinAPP 693, Swissprot P05067) als so genannte Mutation der niederländischenArt der zerebralen Hämorrhagie mit Amyloidose (Dutch typecerebroarterial amyloidosis mutation) beschrieben worden.
DierAmyloid-beta Peptide mit einem Pyroglutaminsäurerest anPosition 3, 11 und/oder 22 sind als zytotoxischer und hydrophoberals Aβ1-40/42/43 beschrieben worden (Saido T. C.2000 Medical Hypotheses 54(3): 427-429).
Dievielfachen N-terminalen Variationen können an verschiedenenStellen durch das β-Sekretase-Enzym β-Stellen-Amyloid-Vorläuferprotein-spaltendesEnzym (β-site amyloid precursor proteincleaving enzyme; BACE)erzeugt werden (Huse J. T. et al. 2002 J. Biol. Chem. 277(18): 16278-16284), und/oder durch Prozessierung durchAminopeptidase. In allen Fällen kann die Cyclisierung nacha)–e) erfolgen, wie oben beschrieben.
Bishergab es keinen experimentellen Nachweis, der die enzymatische Umwandlungvon Glu1-Peptiden zu pGlu-Peptiden durcheine unbekannte Glutamyl-Cyclase (EC) entsprechend Weg a) gestützthat (Garden, R. W., Moroz, T. P., Gleeson, J. M., Floyd,P. D., Li, L. J., Rubakhin, S. S. und Sweedler, J. V. (1999) J Neurochem72, 676-681; Hosoda R. et al. (1998) J NeuropatholExp Neurol. 57, 1089-1095). Bis heute wurde keine derartigeEnzymaktivität identifiziert, die fähig ist, Glu1-Peptide, die N-terminal protoniert sindund eine negativ geladene Glu1 γ-Carboxylateinheitbesitzen, unter schwach alkalischen pH-Bedingungen zu cyclisieren.
QCAktivität gegenüber Gln1-Substratenist unterhalb pH 7 dramatisch verringert. Im Gegensatz dazu scheintes, dass eine Glu1-Umwandlung bei saurenReaktionsbedingungen erfolgen kann (Iwatsubo, T., Saido, T.C., Mann, D. M., Lee, V. M. und Trojanowski, J. Q. (1996) Am J Pathol149, 1823-1830; Russo, C., Saido, T. C., DeBusk,L. M., Tabaton, M., Gambetti, P. und Teller, J. K. (1977) FEBS Lett409, 411-416; Russo, C., Salis, S., Dolcini, V.,Venezia, V., Song, X. H., Teller, J. K. und Schettini, G. (2001)Neurobiol Dis 8, 173-180; Tekirian, T. L., Saido,T. C., Markesbery, W. R., Russell, M. J., Wekstein, D. R., Patel,E. und Geddes, J. W. (1998) J Neuropathol Exp Neurol. 57, 76-94; Russo,C., Violani, E., Salis, S., Venezia, V., Dolcini, V., Damonte, G.,Benatti, U., DArrigo, C., Patrone, E., Carlo, P. und Schettini,G. (2002) J Neurochem 82, 1480-1489; Hosoda, R.,Saido, T. C., Otvos, L., Jr., Arai, T., Mann, D. M., Lee, V. M.,Trojanowski, J. Q. und Iwatsubo, T. (1998) J Neuropathol Exp Neurol.57, 1089-1095; Garden, R. W., Moroz, T. P., Gleeson,J. M., Floyd, P. D., Li, L. J., Rubakhin, S. S. und Sweedler, J.V. (1999) J Neurochem 72, 676-681).
Gemäß dervorliegenden Erfindung wurde untersucht, ob QC fähig ist,Amyloid-beta abgeleitete Peptide zu erkennen und unter leicht saurenBedingungen umzuwandeln. Daher wurden die Peptide [Gln3]Aβ1-11a,Aβ3-11a, [Gln3]Aβ3-11a,Aβ3-21a, [Gln3]Aβ3-21aund [Gln3]Aβ3-40 als potentielleSubstrate des Enzyms synthetisiert und untersucht. Diese Sequenzenwurden ausgewählt, um natürliche N-terminal und C-terminaltrunkierte [Glu3]Aβ Peptide und[Gln3]Aβ Peptide nachzuahmen, diedurch post-translationale Glu-Amidierung auftreten könnten.
Inder vorliegenden Erfindung wurde gezeigt, dass Papaya und humaneQC sowohl Glutaminyl- als auch Glutamyl-Cyclisierung katalysieren.Offenbar ist die primäre physiologische Funktion der QC,die Hormonreifung in endokrinen Zellen durch Glutamin-Cyclisierungvor oder während des Hormon-Sekretionsprozesses abzuschließen.Es ist bekannt, dass solche sekretorischen Vesikel einen saurenpH aufweisen. So könnte eine Nebenaktivität desEnzyms in dem engen pH-Bereich von 5,0 bis 7,0 seine neu entdeckteGlutamyl-Cyclaseaktivität sein, die auch Glu-Aβ Peptideumwandelt. Aufgrund der wesentlich langsamer erfolgenden Glu-Cyclisierungim Vergleich zur Gln-Umwandlung, ist es jedoch fraglich, ob dieGlutamyl-Cyclisierung eine wesentliche physiologische Rolle spielt.In der Pathologie von neurodegenerativen Erkrankungen ist die Glutamyl-Cyclisierungjedoch von Bedeutung.
Beider Untersuchung der pH-Abhängigkeit dieser enzymatischenReaktion fanden wir, dass der unprotonierte N-Terminus fürdie Cyclisierung der Gln1-Peptide essentiellwar und dementsprechend, dass der PKa-Wertdes Substrats identisch zu dem pKa-Wertfür die QC-Katalyse war (siehe 17). Somitstabilisiert QC den intramolekularen nucleophilen Angriff der unprotonierten α-Aminoeinheitauf den γ-Carbonyl-Kohlenstoff, elektrophil aktiviert durchAmidierung (Schema 1).
ImGegensatz zu der einwertigen Ladung, vorhanden in Peptiden, dieN-terminal Glutamin enthalten, ist der N-terminale Glu-Rest in Peptiden,die Glu enthalten, überwiegend zweiwertig geladen bei etwaneutralem pH. Glutamat zeigt pKa-Werte vonetwa 4,2 und 7,5 für die γ-Carboxyl- bzw. die α-Aminoeinheit.D. h. bei neutralem pH und oberhalb ist die γ-Carboxylgruppeunprotoniert, obwohl der α-Amino-Stickstoff zum Teil oder vollständigunprotoniert und nucleophil ist, und so keine elektrophile CarbonylAktivität ausübt. Daher ist intramolekulare Cyclisierungunmöglich.
Indem pH-Bereich von etwa 5,2–6,5, zwischen ihren jeweiligenpKa-Werten, sind die zwei funktionellenGruppen beide in nicht-ionisierter Form vorhanden, in Konzentrationenvon etwa 1–10% (-NH2) oder 10–1% (-COOH)des gesamten N-terminal Glu-enthaltenden Peptids. Folglich sind übereinen leicht sauren pH-Bereich Spezies von N-terminalen Glu-Peptidenvorhanden, die beide Gruppen ungeladen tragen und, deshalb, istes möglich, dass QC das Zwischenprodukt der intramolekularenCyclisierung zu pGlu-Peptid stabilisieren könnte. D. h.,wenn die γ-Carboxylgruppe protoniert ist, ist der Carbonyl-Kohlenstoffelektrophil genug, um einen nucleophilen Angriff durch die unprotonierte α-Aminogruppezu ermöglichen. Bei diesem pH fungiert das Hydroxylionals Abgangsgruppe (Schema 3). Diese Annahmen werden erhärtetdurch die Daten der pH-Abhängigkeit, erhalten fürdie QC-katalysierte Umwandlung von Glu-βNA (siehe Beispiel11). Im Gegensatz zur Glutamin-Umwandlung von Gln-βNA durchQC, verschiebt sich das pH-Optimum der Katalyse in den sauren Bereichum pH 6,0, d. h. der pH-Bereich, in welchem Substratmolekül-Speziesvorhanden sind, die gleichzeitig eine protonierte γ-Carboxyl-und eine unprotonierte α-Aminogruppe tragen. Darüberhinaus stimmt der kinetisch bestimmte pKa-Wertvon 7,55 ± 0,02 hervorragend mit dem der α-Aminogruppevon Glu-βNA überein, bestimmt durch Titration(7,57 ± 0,05).
Physiologischkönnte bei pH 6,0 die Geschwindigkeitskonstante 2. Ordnung(oder Spezifitätskonstante, kcat/KM) der QC-katalysierten Glutamat-Cyclisierungkönnte in dem Bereich von 8000-fach langsamer als die fürdie Glutamin-Cyclisierung sein (17). Dienicht-enzymatische Umsetzung der beiden Modellsubstrate Glu-βNAund Gln-βNA ist jedoch vernachlässigbar, was imEinklang mit der beobachteten vernachlässigbaren Bildungvon pGlu-Peptid in der vorliegenden Erfindung ist. Daher kann fürdie pGlu-Bildung durch QC eine Steigerung von mindestens 108 aus dem Verhältnis der enzymatischengegenüber der nicht-enzymatischen Geschwindigkeitskonstantengeschätzt werden (beim Vergleich der Geschwindigkeitskonstanten2. Ordnung für die Enzymkatalyse mit der jeweiligen Geschwindigkeitskonstanten1. Ordnung für die nicht-enzymatische Cyclisierung istder katalytische Leistungsfaktor 109–1010 M–1 fürdie Gln- bzw. die Glu-Umwandlung). Die Schlussfolgerung aus diesenDaten ist, dass in vivo nur ein enzymatischer Weg denkbar scheint,der zu pGlu-Bildungen führt.
DaQC im Gehirn reichlich vorhanden ist und unter Berücksichtigungder hohen Umsetzungsrate von 0,9 min–1,die vor kurzem für die Reifung von 30 μM (Gln-)TRH-ähnlichemPeptid ((Gln-)TRH-like Peptide) gefunden wurde (Prokai,L., Prokai-Tatrai, K., Ouyang, X., Kim, H. S., Wu, W. M., Zharikova,A. und Bodor, N. (1999) J Med Chem 42, 4563-4571), kannman eine Halbwertszeit für die Cyclisierung von etwa 100Stunden für ein geeignetes Glutamat-Substrat vorhersagen,sofern ähnlich Reaktionsbedingungen zur Verfügunggestellt werden. Angesichts der Kompartmentierung und Lokalisationder Gehirn-QC/EC im sekretorischen Stoffwechselweg, könntendie tatsächlichen in vivo Enzym- und Substrat-Konzentrationenund die Reaktionsbedingungen noch günstiger fürdie enzymatische Cyclisierung in der intakten Zelle sein. Und eineviel schnellere pGlu-Bildung, vermittelt durch QC, könnteerwartet werden, wenn N-terminales Glu zu Gln umgewandelt wird. Invitro wurden beide Reaktionen durch die Anwendung von Inhibitorender QC/EC-Aktivität unterdfrückt (9, 10 und 15).
Zusammenfassendzeigt die vorliegende Erfindung, dass humane QC, die im Gehirn reichlichvorhanden ist, wahrscheinlich ein Katalysator für die Bildungder amyloiden pGlu-Aβ Peptide aus Glu-Aβ und Gln-Aβ Vorläufernist, die mehr als 50% der Plaque-Ablagerungen, die bei Alzheimer-Krankheitgefunden werden, ausmachen. Diese Ergebnisse identifizieren QC/ECals Akteur bei der Bildung seniler Plaques und damit als ein neuesZiel für Medikamente zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit.
Beieiner zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindungwurde festgestellt, dass Amyloid-beta abgeleitete Peptide ein Substratvon Dipeptidylpeptidase IV (DP IV) oder DP IV-ähnlichenEnzymen sind, vorzugsweise Dipeptidylpeptidase II (DP II). DP IV,DP II oder andere DP IV-ähnliche Enzyme setzen ein Dipeptid ausdem N-Terminus des modifizierten Amyloid-beta Peptids (1-11) frei,wobei Amyloid-beta Peptid (3-11) mit Glutamin als N-terminalem Aminosäurerestgeneriert wird. Die Ergebnisse sind in Beispiel 8 gezeigt.
Vorder Spaltung durch DP II, DP IV oder anderen DP IV-ähnlichenEnzymen, kann die Peptidbindung zwischen Asparaginsäure(Rest 1 von Amyloid-beta Peptid) und Alanin (Rest 2 von Amyloid-betaPeptid) isomerisiert werden, wodurch ein Isoaspartylrest erhaltenwird, wie in der Literatur beschrieben (Kuo, Y.-M., Emmerling,M. R., Woods, A. S., Cotter, R. J., Roher, A. E. (1997) BBRC 237,188-191; Shimizu, T., Watanabe, A., Ogawara, M.,Mori, H. und Shirasawa, T. (2000) Arch. Biochem. Biophys. 381, 225-234).
DieseIsoaspartylreste machen die Amyloid-beta Peptide resistent gegenAminopeptidase-Abbau und folglich enthalten die Kern-Plaques hoheMengen an isoAsp1-Amyloid-beta Peptiden,was einen verringerten Umsatz am N-Terminus suggeriert.
Jedochwird in der vorliegenden Erfindung zum ersten Mal gezeigt, dassdas N-terminale Dipeptid H-isoAsp1-Ala2-OH durch Dipeptidylpeptidasen freigesetztwerden kann, insbesondere unter sauren Bedingungen. Darüberhinaus wurde gezeigt, dass Isomerisierung auch einer Spaltung durch β-Sekretasevoraus gehen kann, und dass Isomerisierung die proteolytische Prozessierungbeschleunigen kann, und damit zu einer Lösung einer N-terminalenIsoaspartyl-Bindung aus isoAsp1-Amyloid-betaPeptiden, die anschließend einer Umsetzung durch DP II,DP IV oder DP IV-ähnlichen Enzymen unterzogen wird (Mornand,J. und Clarke, S. (1987) Biochemistry 26, 7798-7805; Kuo,Y.-M., Emmerling, M. R., Woods, A. S., Cotter, R. J., Roher, A.E. (1997) BBRC 237, 188-191). Dementsprechend kann dieHemmung der Bildung von Isoaspartyl zur Verringerung der Spaltungdurch β-Sekretase führen und, dies wiederum, zueiner verminderten Bildung von Amyloid-beta Peptiden. Darüberhinaus würde die Blockade der Umsetzung von isoAsp1-Amyloid-beta Peptid durch Hemmung der DPII, DP IV oder DP IV-ähnlichen Enzymen die Exposition von[Glu3]Aβ gegenüber der QC/EC-katalysiertenBildung von [pGlu3]Aβ verhindern.
Ineiner dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindungkam eine Kombination aus Inhibitoren der DP IV Aktivitätund Inhibitoren der QC für die Behandlung der Alzheimer-Krankheitund von Down-Syndrom eingesetzt werden.
Diekombinierte Wirkung von DP IV und/oder DP IV-ähnlichenEnzyme und von QC wird wie folgt veranschaulicht: a)DP IV und/oder DP IV-ähnliche Enzyme spalten Aβ1-40/42,ein Dipeptid, umfassend H-Asp-Ala-OH, und Aβ3-40/42 werdenfreigesetzt,b) In einer Nebenreaktion katalysiert QC die Cyclisierung vonGlutaminsäure zu Pyroglutaminsäure bei sehr niedrigenGeschwindkeiten,c) Glutaminsäure wird am N-Terminus post-translatorischdurch eine unbekannte enzymatische Aktivität zu Glutaminumgewandelt und anschließend, nach der Prozessierung desN-Terminus des Amyloid-beta Peptids, katalysiert QC die Cyclisierungvon Glutamin zu Pyroglutaminsäure,d) Glutaminsäure wird post-translatorisch durch einechemische Katalyse oder Autokatalyse in Glutamin umgewandelt undin einem zweiten Schritt katalysiert QC die Cyclisierung von Glutaminzu Pyroglutaminsäure nach der Prozessierung des N-Terminusdes Amyloid-beta Peptids,e) Es gibt Mutationen im APP-Gen, die für das Amyloid-betaProtein codieren, was zu Gln an Stelle von Glu an Position 3 vonAβ führt. Nach der Translation und Prozessierungdes N-Terminus katalysiert QC die Cyclisierung von Glutamin zu Pyroglutaminsäure,f) Glutamin wird in die entstehenden Peptidkette von APP eingebaut,aufgrund einer Fehlfunktion einer unbekannten enzymatischen Aktivität,und anschließend katalysiert QC die Cyclisierung von N-terminalem Glutaminzu Pyroglutaminsäure nach der Prozessierung des N-Terminusdes Amyloid-beta Peptids.
DieN-terminalle Gln-Exposition gegenüber QC Aktivitätkann auch durch unterschiedliche Peptidase Aktivitätengetriggert werden. Aminopeptidasen können Asp und Ala sequenziellaus dem N-Terminus von Aβ1-40/41/43 entfernen, und somitAminosäure 3 demaskieren, die zu Cyclisierung neigt. Dipeptidylpeptidasen,wie zum Beispiel DP I, DP II, DP IV, DP 8, DP 9 und DP 10, entfernendas Dipeptid Asp-Ala in einem Schritt. Daher ist die Hemmung vonAminopeptidase- oder Dipeptidylpeptidase Aktivität nützlich,um die Bildung von Aβ3-40/41/43 zu verhindern.
Diekombinierte Wirkung von Inhibitoren der DP IV und/oder DP IV-ähnlicherEnzyme und der Aktivitäts-mindernden Effektoren von QCwird auf die folgende Weise illustriet: a)Die Inhibitoren der DP IV und/oder DP IV-ähnlichen Enzymehemmen die Umwandlung von Aβ1-40/42 zu AβP3-40/42.b) Eine N-terminale Exposition der Glutaminsäure wirddadurch verhindert und eine Umwandlung zu Glutamin, entweder durchenzymatische oder chemische Katalyse, die anschließendzur Bildung von Pyroglutaminsäure führt, ist nichtmöglich.c) Inhibitoren der QC verhindern außerdem die Bildungvon Pyroglutaminsäure bei allen verbleibenden modifiziertenAβ3-40/42 Molekülen und jenen modifizierten Aβ3-40/42Molekülen, die durch Mutationen des APP-Gens generiertwerden.
ImRahmen der vorliegenden Erfindung wurde eine ähnliche kombinierteWirkung von DP IV oder DP IV-ähnlichen Enzymen und QC fürweitere Peptidhormone gezeigt, wie zum Beispiel Glucagon, CC Chemokine undSubstanz P.
Glucagonist ein Polypeptid mit 29 Aminosäuren, das aus den alpha-Inselzellender Bauchspeicheldrüse freigesetzt wird und bewirkt, dassdie Euglykämie durch Anregung der hepatischen Glykogenolyseund Gluconeogenese aufrecht erhalten wird. Trotz ihrer Bedeutunggibt es eine Kontroverse über die Mechanismen, die fürdie Glucagon Ausscheidung im Körper verantwortlich sind. Pospisiliket al. untersuchten den enzymatischen Metabolismus vonGlucagon unter Verwendung von empfindlichen massenspektrometrischen Verfahren,um die molekularen Produkte zu identifizieren. Inkubation von Glucagonmit gereinigter Schweine-Dipeptidylpeptidase IV (DP IV) ergab einesequenzielle Produktion von Glucagon3-29 und Glucagon5-29. Im menschlichenSerum wurde der Abbau zu Glucagon3-29 schnell gefolgt von einerN-terminalen Cyclisierung von Glucagon, die eine weiterer DP IV-vermittelteHydrolyse verhinderte. Ein Bioassay von Glucagon nach Inkubationmit gereinigter DP IV oder normalem Ratten-Serum zeigte einen signifikantenVerlust an hyperglykämischer Aktivität, währendeine ähnliche Inkubation in DP IV-defizientem Ratten-Serumkeinerlei Verlust der Bioaktivität von Glucagon zeigte.Der Abbau, beobachtet mit Hilfe von Massenspektrometrie und Bioassay,wurde durch den spezifischen DP IV Inhibitor Isoleucyl-Thiazolidinblockiert. Diese Ergebnisse identifizieren DP IV als ein primäresEnzym, das beim Abbau und der Inaktivierung von Glucagon beteiligtist. Diese Erkenntnisse haben große Bedeutung fürdie Bestimmung von Glucagonspiegeln in humanem Plasma (Pospisiliket al. Regul Pept 2001 Jan 12; 96 (3): 133-41).
HumanesMonozyten chemotaktisches Protein 2 (Monocyte Chemotactic Protein(MCP)-2) wurde ursprünglich aus stimulierten Osteosarkomzellenisoliert als ein Chemokin, das zusammen mit MCP-1 und MCP-3 produziertwird. Von Coillie et al. (Van Collie, E. et al. 1998 Biochemistry37, 12672-12680) klonierten eine 5\'-Ende verlängerteMCP-2 cDNA aus einer cDNA-Bibliothek aus menschlichem Hoden. Escodierte für ein MCP-2 Protein mit 76 Resten, aber unterschiedsich von der berichteten cDNA Sequenz des aus Knochenmark gewonnenenMCP-2 in Codon 46, das an Stelle eines Gln für ein Lyscodiert. Diese MCP-2Lys46 Variante, verursacht durch einen Einzelnucleotid-Polymorphismus(single nucleotide polymorphism (SNP)), wurde biologisch mit MCP-2Gln46verglichen. Die codierenden Bereiche wurden subkloniert in den bakteriellenExpressionsvektor pHEN1, und nach der Transformation von Escherichiacoli, wurden die zwei MCP-2 Proteinvarianten aus dem Periplasmagewonnen. Edman-Abbau ergab einen Gln Rest am NH2-Terminusan Stelle eines pGlu. rMCP-2Gln46 und rMCP-2Lys46 und die entsprechendenNH2-terminalen cyclischen Ausführungenwurden auf monozytischen Zellen in Calcium Mobilisierungs- und Chemotaxis-Assaysgetestet. Kein signifikanter Unterschied in der biologischen Aktivitätwurde zwischen den Isoformen rMCP-2Gln46 und rRMCP-2Lys46 beobachtet.Jedoch wurde für beide MCP-2 Varianten gezeigt, dass dasNH2-terminale Pyroglutamat fürdie Chemotaxis essentiell ist, aber nicht für die CalciumMobilisierung. Die NH2-terminale Verkürzung vonrMCP-2Lys46 durch die Serinprotease CD26/Dipeptidylpeptidase IV(CD26/DPP IV) resultierte in der Freisetzung des NH2-terminalenDipeptids Gin-Pro, während synthetisches MCP-2 mit einemAmino-terminalen pGlu unberührt blieb. CD26/DPP IV-verkürztesrMCP-2Lys46(3-76) war fast völlig inaktiv, sowohl bei Chemotaxis-als auch bei Signalisierungs-Assays. Diese Beobachtungen legen nahe,dass das NH2-terminale pGlu in MCP-2 fürdie chemotaktische Aktivität notwendig ist, aber auch,dass es das Protein gegen den Abbau durch CD26/DPP IV schützt(van Collie, E. et al. Biochemistry 1998 37, 12672-80).
ImRahmen der vorliegenden Erfindung wurde durch LC/MS-Analyse festgestellt,dass die Bildung des N-terminalen Pyroglutamatrestes, bestimmt beiGlucagon3-29 (Pospisilik et al. 2001) und bei Isoformenvon MCP-2 (van Coillie et al. 1998), durch QC katalysiertwird.
Darüberhinaus wurde durch LC/MS-Untersuchung bewiesen, dass nach der DPIV-katalysierten Entfernung der beiden Dipeptide Lys-Pro und Arg-Provom N-Terminus der Substanz P die verbleibende [Gln1]SubstanzP5-11 durch QC zu [pGlu5]Substanz P5-11umgewandelt wird.
DPIV – Inhibitoren sind in WO99/61431 offenbart. Insbesondere sind DP IV-Inhibitorenoffenbart, die einen Aminosäurerest und eine Thiazolidin-oder Pyrrolidingruppe umfassen, und deren Salze, vorzugsweise L-threo-IsoleucylThiazolidin, L-allo-Isoleucyl Thiazolidin, L-threo-Isoleucyl Pyrrolidin,L-allo-Isoleucyl Thiazolidin, L-allo-Isoleucyl Pyrrolidin, und derenSalze.
WeitereBeispiele für niedermolekulare Dipeptidylpeptidase IV-Inhibitorensind Mittel, wie zum Beispiel Tetrahydroisoquinolin-3-carboxamidDerivate, N-substituierte 2-Cyanopyrrole und -Pyrrolidine, N-(N\'-substituierteGlycyl)-2-cyanopyrrolidine, N-(substituierte Glycyl)-thiazolidine,N-(substituierte Glycyl)-4-cyanothiazolidine, Aminoacyl-borono-prolyl-Hemmer,Cyclopropyl-fusionierte Pyrrolidine und heterocyclische Verbindungen.Inhibitoren der Dipeptidylpeptidase IV sind beschrieben in US 6,380,398, US 6,011,155, US 6,107,317; US 6,110,949; US 6,124,305; US 6,172,081, WO 95/15309, WO 99/61431, WO 99/67278, WO 99/67279, DE 198 34 591, WO 97/40832, DE 196 16 486 C2, WO 98/19998, WO 00/07617, WO 99/38501, WO 99/46272, WO 99/38501, WO 01/68603, WO 01/40180, WO 01/81337, WO 01/81304, WO 01/55105, WO 02/02560 und WO 02/14271, WO 02/04610, WO 02/051836, WO 02/068420, WO 02/076450, WO 02/083128, WO 02/38541, WO 03/000180, WO 03/000181, WO 03/000250, WO 03/002530, WO 03/002531, WO 03/002553, WO 03/002593, WO 03/004496, WO 03/024942 und WO 03/024965, deren Lehren hierindurch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen sind, vor allemim Hinblick auf diese Inhibitoren, ihre Definition, Verwendungen undihre Herstellung.
Bevorzugtfür die Verwendung in Kombination mit Effektoren der QCsind DP IV Inhibitoren, wie zum Beispiel NVP-DPP728A (1-[[[2-[{5-Cyanopyridin-2-yl}amino]ethyl]amino]acetyl]-2-cyano-(S)-pyrrolidin)(Novartis), wie offenbart von Hughes et al. 1999 Biochemistry38 11597-11603, LAF-237 (1-[(3-Hydroxy-adamant-1-ylamino)-acetyl]-pyrrolidin-2(S)-carbonitril);offenbart von Hughes et al., Tagung der American DiabetesAssociation 2002, Abstract Nr. 272 (Novartis), TSL-225(Ttryptophyl-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure),offenbart von Yamada et al. 1998 Bioorg Med Chem Lett 8,1537-1540, 2-Cyanopyrrolidide und 4-Cyanopyrolidide, wieoffenbart von Asworth et al. 1996 Bioorg Med Chem Lett 6,1163-1166 und 2745-2748, FE-999011 offenbart von Sudreet al. 2002 Diabetes 51, 1461-1469 (Ferring) und die Verbindungen,die in WO 01/34594 (Guilford)offenbart sind, bei Verwendung von Dosierungen, wie sie in den obengenannten Referenzen angegeben sind.
Stärkerbevorzugte DP IV-Inhibitoren für die Verwendung in Kombinationmit Effektoren der QC sind Dipeptidverbindungen, in denen die Aminosäurevorzugsweise ausgewählt ist aus einer natürlichenAminosäure, wie, beispielsweise, Leucin, Valin, Glutamin,Glutaminsäure, Prolin, Isoleucin, Asparagin und Asparaginsäure.Die Dipeptid-ähnlichen Verbindungen, die gemäß derErfindung verwendet werden, zeigen bei einer Konzentration (vonDipeptidverbindungen) von 10 μm eine Verringerung der Aktivitätvon Plasma-Dipeptidylpeptidase IV oder DP IV-analogen Enzymaktivitätenvon mindestens 10%, insbesondere von mindestens 40%. Häufigist auch eine Verminderung der Aktivität von mindestens60% oder mindestens 70% in vivo gewünscht. Bevorzugte Verbindungenkönnen auch eine Verminderung der Aktivität vonmaximal 20% oder 30% zeigen.
BevorzugteDipeptidverbindungen sind N-Valyl-prolyl, O-Benzoylhydroxylamin,Alanyl-Pyrrolidin, Isoleucyl-Thiazolidin, wie L-allo-Isoleucyl-Thiazolidin,L-threo-Isoleucyl-Pyrrolidin und Salze derselben, insbesondere dieSalze der Fumarsäure und L-allo-Isoleucyl-Pyrolidin undSalze davon. Besonders bevorzugte Verbindungen sind Glutaminyl-Pyrrolidinund Glutaminyl-Thiazolidin, H-Asn-Pyrrolidin, H-Asn-Thiazolidin, H-Asp-Pyrrolidin,H-Asp-Thiazolidin, H-Asp(NHOH)-Pyrrolidin, H-Asp(NHOH)-Thiazolidin,H-Glu-Pyrrolidin, H-Glu-Thiazolidin, H-Glu(NHOH)-Pyrrolidin, H-Glu(NHOH)-Thiazolidin,H-His-Pyrrolidin-, H-His-Thiazolidin, H-Pro-Pyrrolidin, H-Pro-Thiazolidin,H-Ile-Azididin, H-Ile-Pyrrolidin, H-L-allo-Ile-Thiazolidin, H-Val-Pyrrolidin undH-Val-Thiazolidin und pharmazeutisch akzeptable Salze derselben.Diese Verbindungen sind beschrieben in WO 99/61431 und EP 1 304 327.
Darüberhinaus stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von Effektorender QC in Kombination mit Substrat – ähnlichenPeptidverbindungen bereit, die nützlich für diekompetitive Modulation der Katalyse durch Dipeptidylpeptidase IVsind. Bevorzugte Peptidverbindungen sind 2-Amino-octansäure-Pro-Ile, Abu-Pro-Ile,Aib-Pro-Ile, Aze-Pro-Ile, Cha-Pro-Ile, Ile-Hyp-Ile, Ile-Pro-allo-Ile,Ile-Pro-t-butyl-Gly, Ile-Pro-Val, Nie-Pro-Ile, Nva-Pro-Ile, Orn-Pro-Ile,Phe-Pro-Ile, Phg-Pro-Ile, Pip-Pro-Ile, Ser(Bzl)-Pro-Ile, Ser(P)-Pro-Ile, Ser-Pro-Ile,t-Butyl-Gly-Pro-D-Val, t-Butyl-Gly-Pro-Gly, t-Butyl-Gly-Pro-Ile,t-Butyl-Gly-Pro-Ile-amid, t-Butyl-Gly-Pro-t-butyl-Gly, t-Butyl-Gly-Pro-Val,Thr-Pro-Ile, Tic-Pro-Ile, Trp-Pro-Ile, Tyr(P)-Pro-Ile, Tyr-Pro-allo-Ile, Val-Pro-allo-Ile,Val-Pro-t-butyl-Gly, Val-Pro-Val und pharmazeutisch akzeptable Salzederselben, wobei t-Butyl-Gly definiert ist alsund Ser(Bzl) und Ser(P) sinddefiniert als Benzylserin bzw. Phosphorylserin. Tyr(P) ist definiertals Phosphoryltyrosin. Diese Verbindungen sind in WO 03/002593 offenbart.
Weiterebevorzugte DP IV-Inhibitoren, die gemäß der vorliegendenErfindung in Kombination mit Effektoren der QC verwendet werdenkönnen, sind Peptidylketone, z. B. • 2-Methylcarbonyl-1-N-[(L)-Alanyl-(L)-Valinyl]-(2S)-pyrrolidin-Hydrobromid,2-Methylcarbonyl-1-N-[(L)-Valinyl-(L)-Prolyl-(L)-Valinyl]-(2S)-pyrrolidin-Hydrobromid,• 2-[(Acetyl-oxy-methyl)carbonyl]-1-N-[(L)-Alanyl-(L)-Valinyl]-(2S)-pyrrolidin-Hydrobromid,• 2-[Benzoyl-oxy-methyl)carbonyl]-1-N-[{(L)-Alanyl}-(L)-Valinyl]-(2S)-pyrrolidin-Hydrobromid,• 2-{[(2,6-Dichlorbenzyl)thiomethyl]carbonyl}-1-N-[{(L)-Alanyl}-(L)-Valinyl]-(2S)-Pyrrolidin,• 2-[Benzoyl-oxy-methyl)carbonyl]-1-N-[Glycyl-(L)-Valinyl]-(2S)-pyrrolidin-Hydrobromid,• 2-[([1,3]-Thiazolethiazol-2-yl)carbonyl]-1-N-[{(L)-Alanyl}-(L)-Valinyl]-(2S)-pyrrolidin-Trifluoracetat,• 2-[(Benzothiazolethiazol-2-yl)carbonyl]-1-N-[N-{(L)-Alanyl}-(L)-Valinyl]-(2S)-pyrrolidin-Trifluoracetat,• 2-[(-Benzothiazolethiazol-2-yl)carbonyl]-1-N-[{(L)-Alanyl}-Glycyl)]-(2S)-pyrrolidin-Trifluoracetat,• 2-[(Pyridin-2-yl)carbonyl]-1-N-[N-{(L)-Alanyl}-(L)-Valinyl]-(2S)-pyrrolidin-Trifluoracetat undandere pharmazeutisch akzeptable Salze derselben. Diese Verbindungensind in WO 03/033524 offenbart.
Fernerkönnen gemäß der vorliegenden Erfindungsubstituierte Aminoketone in Kombination mit Effektoren der QC verwendetwerden. Bevorzugte substituierte Aminoketone sind • 1-Cyclopentyl-3-methyl-1-oxo-2-pentanaminiumchlorid,• 1-Cyclopentyl-3-methyl-1-oxo-2-butanaminiumchlorid,• 1-Cyclopentyl-3,3-dimethyl-1-oxo-2-butanaminiumchlorid,• 1-Cyclohexyl-3,3-dimethyl-1-oxo-2-butanaminiumchlorid,• 3-(Cyclopentylcarbonyl)-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoliniumchlorid,• N-(2-Cyclopentyl-2-oxoethyl)cyclohexanaminiumchlorid undandere pharmazeutisch akzeptable Salze derselben.
Inder seltenen Gruppe von Prolin-spezifischen Proteasen wurde vonDP IV ursprünglich angenommen, dass es das einzige Membran-gebundeneEnzym ist, spezifisch für Prolin als vorletzter Rest amAmino-Terminus der Polypeptidkette. Jedoch wurden auch andere Moleküleidentifiziert, sogar solche, die mit DP IV strukturell nicht homologsind, aber eine entsprechende Enzymaktivität besitzen.DP IV-ähnliche Enzyme, die bisher identifiziert wurden,beinhalten z. B. Fibroblasten aktivierendes Protein α (fibroblastactivation Protein α, FAPα), DipeptidylpeptidaseIV β, Dipeptidylaminopeptidase-ähnliches Protein(dipeptidyl aminopeptidase-like Protein), saure N-acetylierte α-verbundeneDipeptidase (N-acetylated α-linked acidic dipeptidase,NAALADase), Prolin-Dipeptidase aus ruhender Zelle (quiescent cellproline dipeptidase, QPP), Dipeptidylpeptidase II, Attractin undDipeptidylpeptidase IV-verwandtes Protein (DPP 8), DPL1 (DPX, DP6),DPL2 und DPP9, beschrieben in Übersichtsartikeln von Sedo Malik (Sedound Malik, 2001, Biochim Biophys Acta, 36506, 1-10) undAbbott und Gorrell (Abbott, C. A. und Gorrell, M. D. 2002in: Langner Ansorge (Hrsg.),Ectopeptidases (Ectopeptidasen). Kluwer Academic/PlenumPublishers, New York, 171-195). Vor kurzem wurde die Klonierungund Charakterisierung von Dipeptidylpeptidase 10 (DPP 10) berichtet(Qi, S. Y. et al. Biochemical Journal Immediate Publication.Veröffentlicht am 28. März 2003 als ManuskriptBJ20021914).
Effektoren,wie dieser Begriff hier verwendet wird, sind definiert als Moleküle,die an Enzyme binden und deren Aktivität in vitro und/oderin vivo steigern oder herabsetzen. Einige Enzyme besitzen Bindungsstellenfür kleine Moleküle, die ihre katalytische Aktivitätbeeinflussen; ein Stimulator-Molekül wird als Aktivatorbezeichnet. Enzyme können sogar mehrere Stellen fürdie Erkennung von mehr als einem Aktivator oder Inhibitor haben.Enzyme können Konzentrationen einer Vielzahl von Molekülendetektieren und nutzen diese Informationen, um ihre eigenen Aktivitätenzu variieren.
Effektorenkönnen enzymatische Aktivität modulieren, da Enzymesowohl aktive als auch inaktive Konformationen annehmen können:Aktivatoren sind positive Effektoren, Inhibitoren sind negativeEffektoren. Effektoren agieren nicht an den aktiven Zentren vonEnzymen, sondern auch an regulatorischen Stellen, oder allosterischenStellen, Begriffe werden benutzt, um zu betonen, dass die regulatorischeStelle ein Element des Enzyms ist, das verschieden ist vom katalytischenZentrum, und um diese Form der Regulation zu unterscheiden von derKompetition zwischen Substraten und Inhibitoren am katalytischenZentrum (Darnell, J., Lodish, H. und Baltimore, D. 1990,Molecular Cell Biology 2nd Edition (Molekularbiologie der Zelle,2. Aufl.), Scientific American Books, New York, Seite 63).
Beiden Peptiden der vorliegenden Erfindung wird jeder Aminosäurerestdurch eine Ein-Buchstaben- oder Drei-Buchstaben-Bezeichnung wiedergegeben,der dem Trivialname der Aminosäure entspricht, in Übereinstimmungmit der folgenden üblichen Liste: AminosäureEin-Buchstaben-SymbolDrei-Buchstaben-SymbolAlaninAAlaArgininRArgAsparaginNAsnAsparaginsäureDAspCysteinCCysGlutaminQGinGlutaminsäureEGluGlycinGGlyHistidinHHisIsoleucinIIleLeucinLLeuLysinKLysMethioninMMetPhenylalaninFPheProlinPProSerinSSerThreoninTThrTryptophanWTrpTyrosinYTyrValinVVal
DerBegriff ”QC”, wie hierin verwendet, umfasst Glutaminyl-Cyclase(QC) und QC-ähnliche Enzyme. QC und QC-ähnlicheEnzyme haben eine identische oder ähnliche Enzymaktivität,weiter definiert als QC Aktivität. In diesem Zusammenhang,QC-ähnliche Enzyme können sich in ihrer molekularenStruktur fundamental von QC unterscheiden.
DerBegriff ”QC Aktivität”, wie hierin verwendet,ist definiert als intramolekulare Cyclisierung von N-terminalenGlutaminresten zu Pyroglutaminsäure (pGlu*) oder von N-terminalemL-Homoglutamin oder L-β-Homoglutamin zu einem cyclischenDerivat der Pyroglutaminsäure (pyro-homoglutamine derivative)unter Freisetzung von Ammoniak. Siehe hierfür Schema 1und Schema 2.
Schema1: Cyclisierung von Glutamin durch QC
Schema2: Cyclisierung von L-Homoglutamin durch QC
DerBegriff ”EC”, wie hierin verwendet, umfasst dieNebenaktivität von QC und QC-ähnlichen Enzymen alsGlutamat-Cyclase (EC), weiter definiert als EC Aktivität.
DerBegriff ”EC Aktivität”, wie hierin verwendet,ist definiert als intramolekulare Cyclisierung von N-terminalenGlutamatresten zu Pyroglutaminsäure (pGlu*) durch QC. Siehehierfür Schema 3.
DerBegriff ”Metall-abhängiges Enzym”, wiehierin verwendet, ist definiert als Enzym(e), das/die ein gebundenesMetallion benötigen, um ihre katalytische Funktion auszuübenund/oder ein gebundenes Metallion benötigen, um die katalytischaktive Struktur zu bilden.
Moleküle,die an Enzyme binden und deren Aktivitäten steigern oderherabsetzen, werden als ”Effektoren” bezeichnet.Effektoren können enzymatische Aktivität verändern,weil Enzyme sowohl aktive als auch inaktive Konformationen annehmenkönnen: Aktivatoren sind positive Effektoren; Inhibitorensind negative Effektoren Effektoren binden an regulatorische Stellenoder allosterische Stellen (aus dem Griechischen für ”andereForm”); ein Begriff, verwendet, um zu betonen, dass dieregulatorische Stelle ein Element des Enzyms ist; das verschiedenist vom katalytischen Zentrum, und um diese Form der Regulationzu unterscheiden von der Kompetition zwischen Substraten und Inhibitorenam katalytischen Zentrum. Gemäß den einzelnenAusführungsformen der vorliegenden Erfindung werden entwederAktivatoren oder Inhibitoren bevorzugt.
Schema3: N-terminale Cyclisierung von ungeladenen Glutamylpeptiden durchQC (EC)
Einweiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Identifizierungvon neuen physiologischen Substraten von QC. Diese wurden identifiziertdurch Durchführung von Cyclisierungsexperimenten mit Säugetierpeptiden,wie in Beispiel 5 beschrieben. Vorher wurden humane QC und PapayaQC isoliert, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die angewandten Verfahrensind in Beispiel 2 beschrieben und die eingesetzte Peptidsynthese istin Beispiel 6 erläutert. Die Ergebnisse der Studie sindin Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1: Neue physiologische Substratevon Glutaminyl-Cyclase (*, qualitativ bestimmt durch MALDI-TOF Experimente)Substrathumane QCPapaya QCKM (μM)kcat (s–1)kcat/KM (mM–1s–1)KM (μM)kcat (s–1)kcat/KM (mM–1s–1)[Gln1]-Gastrin31 ± 154,1 ± 0,61745,2 ± 36,934 ± 225,8 ± 0,5759 ± 30[Gln1]-Neurotensin37 ± 148,8 ± 0,41318,9 ± 24,840 ± 335,7 ± 0,9893 ± 44[Gln1]-FPP87 ± 269,6 ± 0,3800,0 ± 14,9232 ± 932,5 ± 0,4140 ± 4[Gln1]-TRH90 ± 482,8 ± 1,2920,0 ± 27,6---[Gln1]-GnRH53 ± 369,2 ± 1,11305,7 ± 53,2169 ± 982,5 ± 1,9488,2 ± 14,8[Gln3]-glucagon(3-29)**(Gln5]-substance P(5-11)**
AlleAnalysen wurden entweder im optimalen Bereich der Aktivitätund der Stabilität von humaner oder pflanzlicher QC durchgeführt,wie in Beispiel 4 gezeigt.
DieAminosäuresequenzen der physiologisch aktiven Peptide miteinem N-terminalen Glutaminrest, weshalb sie Substrate fürdas QC Enzym sind, sind in Tabelle 2 aufgelistet.
Tabelle2: Aminosäuresequenzen von physiologisch wirksamen Peptidenmit einem N-terminalen Glutaminrest
Ineiner vierten Ausführungsform wurden die Peptide [Gln1]Gastrin (17 und 34 Aminosäurenlang), [Gln1]Neurotensin und [Gln1]FPP als neue physiologische Substrate vonQC identifiziert. Gastrin, Neurotensin und FPP umfassen einen pGluRest an ihrer N-terminalen Position. Für alle Peptide wurdegezeigt, dass dieser N-terminale pGlu Rest aus N-terminalem Glutamindurch QC-Katalyse gebildet wird. Als Folge davon, werden diese Peptidenach der Umwandlung des N-terminalen Glutamin Restes zu pGlu inBezug auf ihre biologische Funktion aktiviert.
Amtransepithelialen Transport beteiligte Zellen (transepithelial transducingcells), insbesondere die Gastrin (G)-Zelle, koordinieren die Sekretionder Magensäure mit der Ankunft der Nahrung im Magen. Jüngste Arbeitenhaben gezeigt, dass mehrere aktive Produkte aus dem Gastrin-Vorläufergebildet werden, und dass es eine Vielzahl von Kontrollpunkten beider Biosynthese von Gastrin gibt. Biosynthetische Vorläuferund Zwischenprodukte (Progastrin und Gly-Gastrin) sind vermeintlicheWachstumsfaktoren; ihre Produkte, die amidierten Gastrine, regulierendie epitheliale Zellproliferation, die Differenzierung der Säureproduzierenden Belegzellen (parietal cells) und der Histamin-sekretierendeenterochromaffin-ähnlichen (ECL)-Zellen und die Expressionvon Genen, die an der Histaminsynthese und der Speicherung in ECL-Zellenbeteiligt sind, sowie die akute Anregung der Säuresekretion.Gastrin stimuliert auch die Produktion von Mitgliedern der epidermalen Wachstumsfaktor(EGF)-Familie, die wiederum die Funktion der Belegzellen hemmen,aber das Wachstum von Oberflächen-Epithelzellen stimulieren.Gastrin Plasma-Konzentrationen sind erhöht bei Subjektenmit Helicobacter pylori, von denen bekannt ist, dass sie ein erhöhtesRisiko für Zwölffingerdarmgeschwür (duodenal ulcerdisease) und Magenkrebs (gastric cancer) haben (Dockray,G. J. 1999 J Physiol 15, 315-324).
DasPeptidhormon Gastrin, freigesetzt aus antralen G-Zellen, ist bekannt,dass es die Synthese und die Freisetzung von Histamin aus ECL-Zellenin der Magenschleimhaut (oxyntic mucosa) via CCK-2-Rezeptoren stimuliert.Das mobilisierte Histamin induziert die Säuresekretiondurch Bindung an die H(2)-Rezeptoren, die sich auf den Belegzellenbefinden. Neuere Studien legen nahe, dass Gastrin, sowohl in seinervollständig amidierten als auch in seiner weniger prozessiertenForm (Progastrin und Glycin-verlängertes Gastrin), auch einWachstumsfaktor für den Magen-Darm-Trakt ist. Es wurdefestgestellt, dass die hauptsächliche trophische Wirkungvon amidiertem Gastrin die die Schleimhaut des Magens betrifft (oxynticmucosa of stomach), wo sie eine gesteigerte Proliferation von Magen-Stammzellenund ECL-Zellen bewirkt, was zu einer erhöhten Beleg- undECL-Zellmasse führt. Auf der anderen Seite scheint daswichtigste trophische Ziel des weniger prozessierten Gastrin (z.B. Glycin-verlängertes Gastrin) die Kolonschleimhaut zusein (Koh, T. J. und Chen, D. 2000 Regul Pept 9337-44).
Ineiner fünften Ausführungsform stellt die vorliegendeErfindung die Verwendung von aktivitätssteigernden Effektorender QC für die Stimulierung der Zellproliferation im Magen-Darm-Traktbereit, insbesondere der Zellproliferation der Magenschleimhaut,der epithelialen Zellproliferation, der Differenzierung von Säure produzierendenBelegzellen und Histamin-sekretierenden enterochromaffin-ähnlichen(ECL)-Zellen, und die Expression von Genen, die an der Histaminsyntheseund der Speicherung in ECL-Zellen beteiligt sind, sowie fürdie Anregung der akuten Säuresekretion bei Säugetierendurch die Aufrechterhaltung oder Erhöhung der Konzentrationvon aktivem [pGlu1]-Gastrin.
Ineiner sechsten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindungdie Verwendung von aktivitätsvermindernden Effektoren derQC für die Behandlung von Zwölffingerdarmgeschwürund Magenkrebs mit oder ohne Helicobacter pylori bei Säugetierenbereit, indem die Umwandlungsgeschwindigkeit von inaktivem [Gln1]Gastrin zu aktivem [pGlu1]Gastrinverringert wird.
Neurotensin(NT) ist ein an der Pathophysiologie der Schizophrenie beteiligtesNeuropeptid, das spezifisch Neurotransmitter-Systeme moduliert,von denen zuvor gezeigt wurde, dass sie bei dieser Krankheit fehlgesteuertsind. Klinische Studien, in denen NT-Konzentrationen in cerebrospinalerFlüssigkeit (CSF) gemessen wurden, ließen eineUntergruppe von schizophrenen Patienten mit einer verminderten CSFNT-Konzentration, die durch wirksame Behandlung mit Psychopharmakawieder hergestellt wird, erkennen. Ein deutlicher Beleg hierfürist auch die Übereinstimmung mit der Beteiligung von NT-Systemenam Wirkungsmechanismus von Psychopharmaka. Die Auswirkungen aufdas Verhalten und die biochemischen Wirkungen von zentral verabreichtemNT ähneln auffallend denen von systemisch verabreichtenPsychopharmaka, und Psychopharmaka erhöhen die Neurotransmissionvon NT. Diese Verkettung von Erkenntnissen führte zu derHypothese, dass NT als ein endogenes Psychopharmakon wirkt. Darüberhinaus ändern typische und atypische Psychopharmaka differenzielldie Neurotransmission von NT in nigrostriatalen und mesolimbischendopaminergen Endbereichen (nigrostriatal and mesolimbic dopamineterminal regions), und diese Effekte sind prädikativ fürBelastungen duch Nebenwirkungen bzw. die Wirksamkeit (Binder,E. B. et al. 2001 Biol Psychiatry 50, 856-872).
Ineiner siebten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindungdie Verwendung von aktivitätssteigernden Effektoren derQC für die Herstellung von Psychopharmaka und/oder fürdie Behandlung von Schizophrenie bei Säugetieren bereit.Die Effektoren der QC halten entweder die Konzentration von aktivem [pGlu1]Neurotensin oder erhöhen diese.
FPP(fertilization promoting peptide), ein Tripeptid, das verwandt istzu TRH (thyrotrophin releasing hormone), wird in Samenplasma gefunden.Kürzlich in vitro und in vivo erhaltene Belege zeigten,dass FPP eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Fruchtbarkeitvon Spermien spielt. Genau genommen stimuliert FPP zunächstunfruchtbare (nonfertilizing) (unkapazierte (uncapacitated)) Spermatozoenzur ”Einschaltung” und zum schneller fruchtbarwerden, aber dann hält es die Fähigkeit an, sodass die Spermatozoen keinen spontanen Verlust des Akrosoms erlebenund deshalb ihre Fruchtbarkeitsvermögen nicht verlieren.Diese Reaktionen werden nachgeahmt, und in der Tat gesteigert, durchAdenosin, das bekannt ist, den Stoffwechselweg der Signalübertragungder Adenylylcyclase (AC)/cAMP zu regulieren. Sowohl fürFPP als auch für Adenosin wurde gezeigt, dass sie die cAMP-Produktionin unkapazitierten Zellen stimulieren, aber sie in kapazitierten Zellenhemmen, wobei FPP-Rezeptoren irgendwie mit Adenosin-Rezeptoren undG-Proteinen interagieren, um eine Regulierung der AC zu erreichen.Diese Ereignisse beeinflussen den Phosphorylierungsgrad von Tyrosinin verschiedenen Proteinen, von denen einige wichtig in der Anfangsphaseder ”Einschaltung” sind, andere sind möglicherweisean der Akrosomreaktion selbst beteiligt. Calcitonin und Angiotensin-II,die auch im Samenplasma gefunden werden, haben in vitro eine ähnlicheWirkung auf unkapazitierte Spermatozoen und können dieAntworten auf FPP steigern. Diese Moleküle haben ähnlicheWirkungen in vivo, sie beeinträchtigen die Fruchtbarkeitdurch Stimulation und halten dann das Fruchtbarkeitsvermögenaufrecht. Jede Verringerung der Verfügbarkeit von FPP,Adenosin, Calcitonin, und Angiotensin-II oder Mängel anihren Rezeptoren tragen zur männlichen Unfruchtbarkeitbei (Fraser, L. R. und Adeoya-Osiguwa, S. A. 2001 VitamHorm 63, 1-28).
Ineiner achten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindungdie Verwendung von aktivitätssenkenden Effektoren der QCfür die Herstellung von die Fruchtbarkeit verhinderndenArzneimitteln und/oder zur Verringerung der Fruchtbarkeit bei Säugetierenbereit. Die aktivitätssenkenden Effektoren der QC verringern dieKonzentration von aktivem [pGlu1]FPP, waszu einer Verhinderung der Spermienreifung (sperm capacitation) undeiner Deaktivierung von Spermienzellen führt. Im Gegensatzdazu konnte gezeigt werden, dass aktivitätssteigernde Effektorender QC in der Lage sind, die Fruchtbarkeit von Männernzu fördern und Unfruchtbarkeit zu behandeln.
Ineiner neunten Ausführungsform wurden weitere physiologischeSubstrate der QC im Rahmen der vorliegenden Erfindung identifiziert.Dabei handelt es sich um [Gln1]CCL2, [Gln1]CCL7, [Gln1]CCL8, [Gln1]CCL16, [Gln1]CCL18und [Gln1]Fractalkine. Siehe Tabelle 2 fürDetails. Diese Polypeptide spielen eine wichtige Rolle bei pathophysiologischenZuständen, wie z. B. der Suppression der Proliferationvon myeloischen Vorläuferzellen, Neoplasie, inflammatorischeReaktionen des Wirts, Krebs, Schuppenflechte, rheumatoide Arthritis,Arteriosklerose, humoralen und Zell-vermittelten Immunantworten,Leukozyten-Adhäsions- und Migrationsprozessen im Endothel.
Mehrerezytotoxische T-Lymphozyten-Peptid-basierte Impfstoffe gegen HepatitisB, humanen Immunschwächevirus und Melanom wurden kürzlichin klinischen Studien untersucht. Ein interessanter Melanom-Impfstoff-Kandidatallein oder in Kombination mit anderen Tumorantigenen ist das DekapeptidELA. Dieses Peptid ist ein Analogon des immundominanten Melan-A/MART-1Antigenpeptids, mit einer N-terminalen Glutaminsäure. Eswurde berichtet, dass die Aminogruppe und die gamma-Carboxylgruppevon Glutaminsäuren sowie die Aminogruppe und gamma-Carboxamidgruppevon Glutaminen leicht kondensieren, um Derivate der Pyroglutaminsäurezu bilden. Um dieses Stabilitätsproblem zu überwinden,wurden mehrere Peptide von pharmazeutischem Interesse mit einerPyroglutaminsäure an Stelle von N-terminalem Glutamin oderN-terminaler Glutaminsäure entwickelt, ohne Verlust derpharmakologischen Eigenschaften. Leider, verglichen mit ELA, löstedas Pyroglutaminsäure-Derivat (PyrELA) und auch das N-terminalacetylierte (acetylcapped) Derivat (AcELA) keine zytotoxische T-Lymphozyten(CTL)-Aktivität aus. Trotz der scheinbar geringfügigenModifikationen, die in PyrELA und AcELA eingeführt sind,weisen diese beiden Derivate wahrscheinlich eine geringere Affinitätals ELA für den spezifischen MHC (Haupthistokompatibilitätskomplex)-KlasseI-Komplex (class I major histocompatibility complex) auf. Folglichmuss die Bildung von PyrELA vermieden werden, um die volle Aktivitätvon ELA zu erhalten (Geck A. et al. 2001, J Pept Res 57(6):528-38). Vor kurzem wurde gefunden, dass auch das EnzymGlutaminyl-Cyclase (QC) in Melanomen überexprimiert wird(Ross D. T. et al. 2000, Nat Genet 24: 227-35).
Ineiner zehnten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindungdie Verwendung von Effektoren der QC für die Herstellungeines Arzneimittels zur Behandlung von pathophysiologischen Zuständenbereit, wie z. B. Suppression der Proliferation von myeloischenVorläuferzellen, Neoplasie, inflammatorische Reaktionen desWirts, Krebs, maligne Metastasen, Melanom, Schuppenflechte, rheumatoideArthritis, Arteriosklerose, verminderte humorale und Zell-vermittelteImmunantworten, Leukozyten-Adhäsions- und Migrationsprozesseim Endothel.
Ineiner elften Ausführungsform wurde [Gln1]OrexinA als ein physiologisches Substrat der QC im Rahmen der vorliegendenErfindung identifiziert. Orexin A ist ein Neuropeptid, dass einebedeutende Rolle bei der Regulierung der Nahrungsaufnahme und Schlaf-Wachsamkeitspielt, möglicherweise, indem es die komplexen Verhaltens-und physiologischen Reaktionen dieser komplementären homöostatischenFunktionen. Es spielt auch eine umfassende Rolle bei der homöostatischenRegulation des Energiestoffwechsels, der autonomen Funktion, demHormonhaushalt und der Regulierung der Körperflüssigkeiten.
Ineiner zwölften Ausführungsform stellt die vorliegendeErfindung die Verwendung von Effektoren der QC für dieHerstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von eingeschränkterNahrungsaufnahme und Schlaf-Wachsamkeit, beeinträchtigterhomöostatischer Regulierung des Energiestoffwechsels, beeinträchtigterautonomer Funktion, beeinträchtigtem Hormonhaushalt undbeeinträchtigter Regulierung der Körperflüssigkeitenbereit.
EineVerlängerung des Polyglutamin-Bereichs bei mehreren Proteinenführt zu neurodegenerativen Erkrankungen, wie Parkinson-Krankheitund Kennedy-Krankheit. Der Mechanismus bleibt daher weitgehend unbekannt.Die biochemischen Eigenschaften der Polyglutamin-Wiederholungen(polyglutamine repeats) liefern eine mögliche Erklärung:endolytische Spaltung bei einer Glutaminyl-Glutaminyl Bindung, gefolgtvon einer Pyroglutamat-Bildung kann zur Pathogenese beitragen, indemdie katabole Stabilität, Hydrophobie, Amyloidogenität(amyloidogenicity) und die Neurotoxizität der Polyglutaminyl-Proteinegesteigert wird (Saido, T; Med Hypotheses (2000) Mar; 54(3):427-9).
Ineiner dreizehnten Ausführungsform stellt die vorliegendeErfindung daher die Verwendung von Effektoren der QC fürdie Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der Parkinson-Krankheitund von Huntington-Krankheit bereit.
Ineiner vierzehnten Ausführungsform stellt die vorliegendeErfindung einen allgemeinen Weg zur Verringerung oder Hemmung derenzymatischen Aktivität von QC bereit. Beispiele fürhemmende Verbindungen werden ebenfalls bereit gestellt.
DieHemmung einer Säugetier-QC wurde zunächst nurfür 1,10-Phenanthrolin und reduziertes 6-Methylpterin erkannt(Busby, W. H. J. et al. 1987 J Biol Chem 262, 8532-8536).EDTA hemmte, QC nicht, und somit wurde gefolgert, dass QC kein Metall-abhängigesEnzym ist (Busby, W. H. J. et al. 1987 J Biol Chem 262,8532-8536, Bateman, R. C. J. et al. 2001 Biochemistry40, 11246-11250, Booth, R. E. et al. 2004 BMC Biology2). In der vorliegenden Erfindung wird jedoch gezeigt,dass humane QC und andere Tier-QCs Metall-abhängige Enzymesind, wie deutlich gemacht durch die Hemmungseigenschaften der QCdurch 1,10-Phenanthrolin, Dipicolinsäure, 8-Hydroxychinolinund anderen Chelatoren (18, 19)und durch die Reaktivierung der QC durch Übergangsmetallionen(20). Schließlich wird die Metallabhängigkeitdurch einen Sequenzvergleich mit anderen Metall-abhängigenEnzymen dargelegt, der auch bei humaner QC eine Konservierung derchelierenden Aminosäurereste zeigt (21). DieWechselwirkung von Verbindungen mit dem im aktiven Zentrum gebundenenMetallion stellt einen allgemeinen Weg zur Verringerung oder Hemmung derQC Aktivität dar.
Inder vorliegenden Erfindung wird gezeigt, dass Imidazolderivate wirksameInhibitoren der QC sind. Unter Verwendung des kontinuierlichen Assay(siehe Beispiel 2 für Details) wurden viele Imidazolderivatein Bezug auf ihre Fähigkeit zur Hemmung der humanen QCals einem Mitglied der hochkonservierten Säugetier-QCsanalysiert.
Somitstellt die vorliegende Erfindung Imidazolderivate und Histidin undseine Derivate bereit als aktivitätsvermindernde Effektorender QC und ihre Eigenschaften in Bezug auf die Hemmungsart und -Wirksamkeit.Strukturen und Ki-Werte sind in den Tabellen3 und 4 gezeigt. Die Ergebnisse sind im Detail in Beispiel 7 beschrieben.
Tabelle3: Inhibitionskonstanten von Imidazolderivaten bei durch humaneQC-katalysierter Reaktion. Bestimmungen wurden durchgeführtbei 30°C in 0,05 M Tris-HCl pH 8,0, enthaltend 5 mM EDTA.
Tabelle4: Hemmung der QC durch L-Histamin und seine zwei biologischen Metaboliten(auch bekannt als tele-Methylhistamin).
Überraschenderweisewurde während der Charakterisierung der enzymatischen Aktivitätfestgestellt, dass neben einem N-terminalen Glutaminylrest, N-terminale β-homo-Glutaminylresteauch die Eigenschaften als Substrate der QCs aus Pflanzen und Säugetierenerfüllen. Der N-terminale β-homo-Glutaminylrestwurde in einen fünfgliedrigen Lactamring umgewandelt durchKatalyse von humaner QC bzw. Papaya QC. Die Ergebnisse sind in Beispiel5 beschrieben. Das verwendete Verfahren ist in Beispiel 2 dargestelltund die Peptidsynthese wurde wie in Beispiel 6 beschrieben durchgeführt.
Eineweitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindungumfasst ein Screening-Verfahren für Effektoren der QC.
Einbevorzugtes Screening-Verfahren zur Identifizierung von aktivitätsänderndenEffektoren der QC aus einer Gruppe von Verbindungen umfasst dieSchritte: a) Kontaktieren der Verbindungenmit QC unter Bedingungen, die eine Bindung zwischen diesen erlauben;b) Hinzufügen eines Substrats der QC;c) Beobachtung der Umwandlung des Substrats oder gegebenenfallsMessung der verbleibenden QC-Aktivität; undd) Berechnung von Änderungen bei der Substratumwandlungund/oder der Enzymaktivität der QC, um einen aktivitätsänderndenEffektor zu identifizieren.
Einweiteres bevorzugtes Screening-Verfahren betrifft ein Verfahrenzur Identifizierung und Auswahl von Effektoren, die direkt oderindirekt mit dem im aktiven Zentrum von QC gebundenen Metallioninteragieren, und umfasst folgende Schritte: a)Kontaktieren der Verbindungen mit QC unter Bedingungen, die eineBindung zwischen diesen erlauben;b) Hinzufügen eines Substrats der QC, welches von QCumgewandelt wird;c) Beobachtung der Umwandlung des Substrats oder gegebenenfallsMessung der verbleibenden QC-Aktivität; undd) Berechnung von Änderungen bei der Substratumwandlungund/oder der Enzymaktivität der QC, wobei Änderungenbenutzt werden können, um einen aktivitätsänderndenEffektor der QC zu identifizieren.
Fürdie Verwendung in den vorstehend beschriebenen Screening-Verfahrenbevorzugt sind Säugetier QC oder Papaya QC. Besonders bevorzugtist Säugetier QC, da die durch diese Screening-Verfahrenidentifizierten Effektoren für die Behandlung von Krankheitenin Säugetieren, insbesondere bei Menschen, verwendet werdensollen.
DieMittel, die durch die vorstehend beschriebenen Screening-Verfahrenausgewählt werden, können wirken durch eine Verminderungder Umwandlung von mindestens einem Substrat der QC (negative Effektoren,Inhibitoren) oder durch die Steigerung der Umwandlung von mindestenseinem Substrat der QC (positive Effektoren, Aktivatoren).
DieVerbindungen der vorliegenden Erfindung können in Säureadditionssalze,insbesondere pharmazeutisch akzeptable Säureadditionssalze,umgewandelt werden.
DieSalze der Verbindungen der Erfindung können in Form vonanorganischen oder organischen Salzen vorliegen.
DieVerbindungen der vorliegenden Erfindung können umgewandeltwerden in und eingesetzt werden als Säureadditionssalze,insbesondere pharmazeutisch akzeptable Säureadditionssalze.Ein pharmazeutisch akzeptables Salz nimmt in der Regel eine Forman, bei der eine basische Seitenkette mit einer anorganischen oderorganischen Säure protoniert ist. Repräsentativeorganische oder anorganische Säuren umfassen Salzsäure,Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure, Schwefelsäure,Salpetersäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Propionsäure,Glykolsäure, Milchsäure, Bernsteinsäure,Maleinsäure, Fumarsäure, Apfelsäure,Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure,Mandelsäure, Methansulfonsäure, Hydroxyethansulfonsäure,Benzensulfosäure, Oxasäure, Pamosäure,2-Naphthalinsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure (p-toulenesulfonicacid), Cyclamsäure (cyclohexanesulfamic acid), Salicylsäure,Saccharinsäure oder Trifluoressigsäure. Alle pharmazeutischakzeptablen Säureadditionssalzformen der Verbindungen dervorliegenden Erfindung sollen in den Bereich dieser Erfindung einbezogensein.
InAnbetracht der engen Beziehung zwischen den freien Verbindungenund den Verbindungen in Form ihrer Salze soll auch ein entsprechendesSalz gemeint sein, sobald eine Verbindung in diesem Zusammenhanggenannt wird, sofern dies unter den gegebenen Umständenmöglich oder geeignet ist.
Soferndie Verbindungen gemäß dieser Erfindung mindestensein chirales Zentrum aufweisen, können sie dementsprechendals Enantiomere existieren. Sofern die Verbindungen zwei oder mehrchirale Zentren besitzen, können sie darüber hinausals Diastereomere existieren. Es sollte verstanden werden, dassalle diese Isomere und Mischungen derselben im Rahmen der vorliegendenErfindung umfasst sind. Außerdem können einigeder kristallinen Formen der Verbindungen als Polymorphe existierenund als solche sind sie dazu bestimmt, in der vorliegenden Erfindungenthalten zu sein. Darüber hinaus können einigeder Verbindungen Solvate mit Wasser (d. h. Hydrate) oder üblichenorganischen Lösungsmitteln bilden, und solche Solvate sind auchdazu bestimmt, in den Umfang dieser Erfindung einbezogen zu sein.
DieVerbindungen, einschließlich ihrer Salze, könnenauch in Form ihrer Hydrate erhalten werden oder auch andere Lösungsmitteleinschließen, die für ihre Kristallisation verwendetwerden.
Ineiner weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindungein Verfahren bereit zur Vorbeugung oder Behandlung eines Zustands,der durch Modulation der QC-Enzymaktivität vermittelt wird,in einem bedürftigen Subjekt, welches das Verabreicheneiner der Verbindungen der vorliegenden Erfindung oder von pharmazeutischenZusammensetzungen derselben in einer Menge und einem Dosierungsregime,therapeutisch wirksam, um den Zustand zu behandeln, umfasst. Darüberhinaus umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung der Verbindungender vorliegenden Erfindung, und ihrer entsprechenden pharmazeutischakzeptablen Säureadditionssalzformen, für dieHerstellung eines Arzneimittels zur Vorbeugung oder Behandlung einesZustandes, der durch die Modulation der QC-Aktivität ineinem Subjekt vermittelt wird. Die Verbindung kann einem Patientendurch jede übliche Art der Verabreichung verabreicht werden,einschließlich, aber nicht beschränkt auf, intravenöse,orale, subkutane, intramuskuläre, intradermale, parenteraleVerabreichung und Kombinationen derselben.
Ineiner weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft dieErfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, d. h. Arzneimittel,die mindestens eine Verbindung der Erfindung oder deren Salze enthalten,optional in Kombination mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablenTrägern und/oder Lösungsmitteln.
Diepharmazeutischen Zusammensetzungen können, zum Beispiel,in Form von parenteralen oder enteralen Formulierungen sein undgeeignete Träger enthalten, oder sie können inForm von oralen Formulierungen sein, die geeignete Träger,geeignet für die orale Verabreichung, enthalten können.Vorzugsweise sind sie in Form von oralen Formulierungen.
DieEffektoren der QC-Aktivität, verabreicht gemäß derErfindung, können verwendet werden in pharmazeutisch verabreichbarenFormulierungen oder Formulierungskomplexen als Inhibitoren oderin Kombination mit Inhibitoren, Substraten, Pseudosubstraten, Inhibitorender QC-Expression, Bindungsproteinen oder Antikörpern vonjenen Enzymproteinen, die die QC-Proteinkonzentration bei Säugetierenverringern. Die Verbindungen der Erfindung machen es möglich,die Behandlung individuell an die Patienten und Krankheiten anzupassen,wobei es insbesondere möglich ist, individuelle Unverträglichkeiten,Allergien und Nebenwirkungen zu vermeiden.
DieVerbindungen zeigen auch unterschiedliche Grade der Aktivitätals Funktion der Zeit. Der behandelnde Arzt erhält dadurchdie Möglichkeit, unterschiedlich auf die individuelle Situationder Patienten zu reagieren: auf der einen Seite ist er in der Lage,die Geschwindigkeit des Beginns der Wirkung und, auf der anderenSeite, die Dauer der Wirkung und insbesondere die Intensitätder Wirkung präzise anzupassen.
Einbevorzugtes Behandlungsverfahren gemäß der vorliegendenErfindung stellt einen neuen Ansatz für die Vorbeugungoder Behandlung eines Zustandes dar, der durch Modulation der QC-Enzymaktivitätbei Säugetieren vermittelt wird. Es ist vorteilhaft einfach,geeignet für die kommerzielle Anwendung und zur Verwendungbei Säugetieren und, insbesondere in der Humanmedizin,insbesondere zur Behandlung von Krankheiten, die auf unausgeglichenerKonzentration von physiologisch aktiven QC-Substraten beruhen, z.B. aufgeführt in den Tabellen 1 und 2.
DieVerbindungen können vorteilhaft verabreicht werden, zumBeispiel, in Form von pharmazeutischen Zubereitungen, die den Wirkstoffin Kombination mit üblichen Zusätzen, wie Verdünnungsmitteln,Hilfsstoffen und/oder Trägern, bekannt aus dem Stand derTechnik, enthalten. Zum Beispiel können sie parenteral verabreichtwerden (z. B. i. v. in physiologischer Kochsalzlösung)oder enteral (z. B. oral, formuliert mit üblichen Trägern).
Abhängigvon ihrer endogenen Stabilität und ihrer Bioverfügbarkeit,kann eine Dosis oder mehrere Dosen der Verbindungen pro Tag gegebenwerden, um die gewünschte Normalisierung der Blutzuckerwertezu erreichen. Zum Beispiel kann ein solcher Dosisbereich beim Menschenim Bereich von etwa 0,01 mg bis 250,0 mg pro Tag sein, vorzugsweiseim Bereich von etwa 0,01 bis 100 mg der Verbindung pro kg Körpergewicht.
DurchVerabreichung von Effektoren der QC-Aktivität an ein Säugetierkönnte es möglich sein, Zustände, ausgewähltaus Alzheimer-Krankheit, Down-Syndrom, Magengeschwür undMagenkrebs mit oder ohne Heliobacter pylori Infektionen, pathogenenpsychotischen Zuständen, Schizophrenie, Unfruchtbarkeit,Neoplasie, inflammatorischen Reaktionen des Wirts, Krebs, Schuppenflechte,rheumatoide Arthritis, Arteriosklerose, beeinträchtigtehumorale und Zell-vermittelte Immunantworten, Leukozyten-Adhäsions-und Migrationsprozesse im Endothel, beeinträchtigte Nahrungsaufnahme,Schlaf-Wachsamkeit, beeinträchtigte homöostatischeRegulierung des Energiestoffwechsels, beeinträchtigte autonomeFunktion, beeinträchtigter Hormonhaushalt und beeinträchtigteRegulierung der Körperflüssigkeiten, zu verhindernoder zu lindern.
Fernerkönnte es durch die Verabreichung von Effektoren der QC-Aktivitätan ein Säugetier möglich sein, die Zellproliferationdes Magen-Darm-Trakts zu stimulieren, vorzugsweise die Proliferationvon Zellen der Magenschleimhaut, Epithelzellen, akuter Säuresekretionund der Differenzierung der Säure produzierenden Belegzellenund Histamin-sekretierenden enterochromaffin-ähnlichenZellen.
Darüberhinaus könnte die Verabreichung der QC-Inhibitoren an Säugetierezu einem Verlust der Funktion einer Samenzelle führen,und damit zur Unterdrückung der männlichen Fruchtbarkeit.Somit stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren fürdie Regulierung und Kontrolle der männlichen Fruchtbarkeitund die Verwendung von aktivitätsmindernden Effektorender QC für die Herstellung von Arzneimitteln zur Empfängnisverhütungfür Männer bereit.
Darüberhinaus kann es durch die Verabreichung von Effektoren der QC-Aktivitätan ein Säugetier möglich sein, die Proliferationvon myeloischen Vorläuferzellen zu supprimieren.
DieVerbindungen, eingesetzt gemäß der Erfindung,können dementsprechend in einer an sich bekannten Weisein übliche Formulierungen umgewandelt werden, wie z. B.,beispielsweise Tabletten, Kapseln, Dragees, Pillen, Zäpfchen,Granulate, Aerosole, Sirupe, flüssige, feste und Creme-ähnlicheEmulsionen und Suspensionen und Lösungen, unter Verwendunginerter, nicht giftiger, pharmazeutisch geeigneter Trägerund Zusatzstoffe oder Lösungsmittel. In jeder dieser Formulierungensind die therapeutisch wirksamen Verbindungen vorzugsweise in einerKonzentration von etwa 0,1 bis 80 Gew.-%, stärker bevorzugtvon 1 bis 50 Gew.-%, der gesamten Mischung, vorhanden, d. h., inMengen, die ausreichen, um die genannte Breite der Dosierung zuerhalten.
DieSubstanzen können verwendet werden als Arzneimittel inder Form von Dragees, Kapseln, beißbaren Kapseln, Tabletten,Tropfen, Sirupen oder auch als Zäpfchen oder als Nasensprays.
DieFormulierungen können vorteilhaft hergestellt werden, zumBeispiel, indem der Wirkstoff gestreckt wird mit Lösungsmittelnund/oder Trägern, optional unter Verwendung von Emulgatorenund/oder Dispergiermitteln, wobei es möglich ist, zum Beispiel,in den Fällen, in denen Wasser als Verdünnungsmittelverwendet wird, optional organische Lösungsmittel als Hilfslösungsmittelzu verwenden.
Beispielefür Hilfsstoffe, die im Zusammenhang mit der vorliegendenErfindung nützlich sind, umfassen: Wasser, nicht toxischeorganische Lösungsmittel, wie z. B. Paraffine (z. B. Fraktionenvon natürlichem Öl), Pflanzenöle (z.B. Rapsöl, Erdnussöl, Sesamöl), Alkohole(z. B. Ethylalkohol, Glycerol), Glykole (z. B. Propylenglykol, Polyethylenglykol);feste Trägerstoffe, wie z. B., beispielsweise natürlicheMineralien in Pulverform (z. B. hochdisperses Silica, Silikate),Zucker (z. B. Rohzucker, Laktose und Dextrose); Emulgatoren, wiez. B. nicht-ionische und anionische Emulgatoren (z. B. Polyoxyethylen-Fettsäureester,Polyoxyethylen-Fettalkoholether, Alkylsulfonate und Arylsulphonate),Dispergiermittel (z. B. Lignin, Sulfitlaugen, Methylcellulose, Stärke undPolyvinylpyrrolidon) und Gleitmittel (z. B. Magnesiumstearat, Talkum,Stearinsäure und Natriumlaurylsulfat) und optional Aromastoffe.
DieVerabreichung kann auf übliche Weise erfolgen, vorzugsweiseenteral oder parenteral, insbesondere oral. Im Falle der enteralenVerabreichung können Tabletten neben den genannten Trägernweitere Zusatzstoffe enthalten, wie z. B. Natriumcitrat, Calciumcarbonatund Calciumphosphat zusammen mit verschiedenen Zusätzen,wie z. B. Stärke, vorzugsweise Kartoffelstärke,Gelatine und dergleichen. Darüber hinaus könnenzur Tablettierung gleichzeitig Gleitmittel, wie z. B. Magnesiumstearat,Natriumlaurylsulfat und Talkum, verwendet werden. Im Fall von wässrigenSuspensionen und/oder Elixieren, bestimmt zur oralen Verabreichung,können verschiedene Geschmacksverbesserer und Farbstoffezu den Wirkstoffen zusätzlich zu den oben genannten Hilfsstoffenzugesetzt werden.
ImFall der parenteralen Verabreichung können Lösungender Wirkstoffe unter Verwendung geeigneter flüssiger Trägereingesetzt werden. Im Allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen,im Fall der intravenösen Verabreichung, Mengen von etwa0,01 bis 2,0 mg/kg, vorzugsweise etwa von 0,01 bis 1,0 mg/kg Körpergewichtpro Tag zu verabreichen, um effektive Ergebnisse zu erzielen und,im Fall der enteralen Verabreichung ist die Dosierung etwa 0,01bis 2 mg/kg, vorzugsweise etwa von 0,01 bis 1 mg/kg Körpergewichtpro Tag.
Nichtsdestotrotzkann es jedoch in einigen Fällen notwendig sein, von dengenannten Mengen abzuweichen, abhängig vom Körpergewichtdes Versuchstieres oder des Patienten, oder von der Art des Verabreichungswegs,aber auch auf der Grundlage der Tierarten und ihrer individuellenReaktion auf das Medikament oder dem Intervall, in welchem die Verabreichungerfolgt. Dementsprechend kann es in einigen Fällen ausreichendsein, weniger als die oben genannte Mindestmenge zu verwenden, währendin anderen Fällen die genannte obere Grenze überschrittenwerden muss. In Fällen, in denen relativ großeMengen verabreicht werden, kann es ratsam sein, diese Mengen inmehrere Einzeldosen über den Tag zu verteilen. Fürdie Verabreichung in der Humanmedizin wird die gleiche Dosierungsbreitezur Verfügung gestellt. Die vorstehenden Ausführungengelten in diesem Fall analog.
Beispiele für pharmazeutischeFormulierungen1. Kapseln, enthaltend 100 mg einer Verbindungder Erfindung pro Kapsel:Füretwa 10.000 Kapseln wird eine Lösung der folgenden Zusammensetzunghergestellt: Verbindungder Erfindung1.0kgGlycerol0.5kgPolyethylenglykol3.0kgWasser0.5kg5.0 kg
DieLösung wird in weiche Gelatinekapseln in an sich bekannterWeise eingeführt. Die Kapseln sind geeignet zum Kauen oderzum Schlucken.
2. Tabletten oder beschichtete Tablettenoder Dragees, enthaltend 100 mg einer Verbindung der Erfindung:Diefolgenden Mengen beziehen sich auf die Herstellung von 100.000 Tabletten:Verbindung der Erfindung, feingemahlen10,0kgGlucose4,35kgLactose4,35kgStärke4,50kgCellulose,fein gemahlen4,50kg
Dievorstehenden Bestandteile werden gemischt und dann mit einer Lösungversehen, hergestellt aus Polyvinylpyrrolidon2,0kgPolysorbat0,1kgundWasserca.5,0 kg und in einer an sich bekannten Weise granuliert,indem die feuchte Masse durch ein Gitter gelassen wird und, nachder Zugabe von 0,2 kg Magnesiumstearat, getrocknet wird. Die fertigeTablettenmischung von 30,0 kg wird verarbeitet, um gewölbteTabletten mit einem Gewicht von 300 mg zu bilden. Im Idealfall könnendie Tabletten in einer an sich bekannten Weise beschichtet odermit Zucker beschichtet sein.
Diepharmazeutischen Zusammensetzungen, durchgehend definiert in derBeschreibung, enthalten vorzugsweise eine Kombination aus mindestenseinem Effektor der QC-Aktivität und mindestens einem DP IV-Inhibitor.Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen sind besonders nützlichfür die Behandlung der Alzheimer-Krankheit und des Down-Syndroms.
Beispiel 1: Herstellung von humaner QCund Papaya QCWirtstämme und MedienPichiapastoris Stamm X33 (AOX1, AOX2), verwendet für die Expressionvon humaner QC wurde wachsen gelassen, transformiert und analysiertgemäß den Anweisungen des Herstellers (Invitrogen).Die benötigten Medien für P. pastoris, d. h. gepuffertesGlycerol (BMGY) Komplex- oder Methanol (BMMY) Komplexmedium unddas Basalsalzmedium zur Fermentation wurden nach den Empfehlungendes Herstellers zubereitet.
Molekulare Klonierung von Plasmidvektoren,die für die humane QC codierenAlleKlonierungsverfahren wurden unter Anwendung von molekularbiologischenStandardverfahren durchgeführt. Für die Expressionin Hefe wurde der Vektor pPICZαB (Invitrogen) verwendet.Der pQE-31 Vektor (Qiagen) wurde benutzt, um die humane QC in E.coli zu exprimieren. Die cDNA der reifen QC, beginnend mit Codon38, wurde im Rahmen fusioniert mit dem durch das Plasmid codierten6 × Histidin-Tag. Nach der Amplifikation unter Verwendungder Primer pQCyc-1 und pQCyc-2 (Tabelle 1) und Subklonierung wurdedas Fragment in den Expressionsvektor unter Verwendung der Restriktionsschnittstellenvon SphI und HindIII eingefügt.
Transformation von P. pastoris und Expressionim kleinen MaßstabPlasmid-DNAwurde in E. coli JM109 amplifiziert und gereinigt gemäß denEmpfehlungen des Herstellers (Qiagen). In dem verwendeten Expressionsplasmid,pPICZαB, werden drei Restriktionsschnittstellen für dieLinearisierung bereit gestellt. Da SacI und BstX1 innerhalb dercDNA von QC schneiden, wurde PmeI für die Linearisierunggewählt. 20–30 μg Plasmid-DNA wurdenmit PmeI linearisiert, mit Ethanol gefällt, und in sterilem,entionisiertem Wasser gelöst. 10 μg der DNA wurdendann eingesetzt für die Transformation der kompetentenP. pastoris Zellen durch Elektroporation gemäß denAnweisungen des Herstellers (BioRad). Die Selektion erfolgte aufPlatten, enthaltend 150 μg/ml Zeocin. Eine Transformationunter Verwendung des linearisierten Plasmids lieferte mehrere hundertTransformanten.
Umdie rekombinanten Hefeklone auf QC-Expression zu testen, wurdendie Rekombinanten für 24 h in 10 ml konischen Röhrchen,enthaltend 2 ml BMGY, wachsen gelassen. Anschließend wurdedie Hefe zentrifugiert und resuspendiert in 2 ml BMMY, enthaltend0,5% Methanol. Diese Konzentration wurde aufrecht erhalten durchZugabe von Methanol, alle 24 h bis 72 h. Anschließend wurdedie QC-Aktivität im Überstand bestimmt. Das Vorhandenseindes Fusionsproteins wurde mittels Western Blot-Analyse unter Verwendungeines gegen das 6 × Histidin-Tag gerichteten Antikörpers(Qiagen) bestätigt. Klone, die die höchste QC-Aktivitätzeigten, wurden für weitere Experimente und die Fermentationausgewählt.
Expression in einem Fermenter in großemMaßstabDieExpression von QC wurde durchgeführt in einem 51 Reaktor(Biostat B, B. Braun Biotech), im Wesentlichen, wie beschriebenin den ”Richtlinien für den Fermentationsprozessfür Pichia” (Invitrogen). Kurz gesagt,die Zellen wurden wachsen gelassen in dem Basalsalzmedium fürdie Fermentation, supplementiert mit Spuren von Salzen und mit Glycerolals einziger Kohlenstoffquelle (pH 5,5). In einer ersten Batchphasefür etwa 24 h und einer anschließenden Fed-Batch-Phasefür etwa 5 h wurde Zellmasse angesammelt. Sobald ein Zellnassgewichtvon 200 g/l erreicht war, wurde eine Induktion der QC-Expressionunter Verwendung von Methanol durchgeführt, wobei ein dreistufigesFütterungsprofil über die gesamte Gärungszeitvon etwa 60 h eingesetzt wurde. Anschließend wurden dieZellen aus dem QC-enthaltenden Überstand entfernt durchZentrifugation bei 6000 × g, 4°C für15 min. Der pH-Wert wurde auf 6,8 durch Zugabe von NaOH eingestellt,und die daraus resultierende trübe Lösung wurdeerneut zentrifugiert bei 37000 × g, 4°C für40 min. In Fällen fortgesetzter Trübung wurdeein zusätzlicher Filtrationsschritt unter Verwendung einerCellulosemembran (Porenweite 0,45 μm) angewandt.
Reinigung von mit 6 × Histidin-Tagversehener QC, exprimiert in P. pastorisDiemit His-Tag versehene QC wurde zuerst durch immobilisierte Metall-Affinitätschromatographie (IMAC)gereinigt. In einer typischen Reinigung wurden 1000 ml Kulturüberstandaufgetragen auf eine mit Ni2+-beladene chelatierendeSepharose FF-Säule (1,6 × 20 cm, Pharmacia), diemit 50 mM Phosphatpuffer, pH 6,8, enthaltend 750 mM NaCl, bei einerFließgeschwindigkeit von 5 ml/min äquilibriertwurde. Nach dem Waschen mit 10 Säulenvolumen Äquilibrierungspufferund 5 Säulenvolumen Äquilibrierungspuffer, enthaltend 5mM Histidin, wurde das gebundene Protein eluiert durch einen Wechselzu 50 mM Phosphatpuffer, pH 6,8, enthaltend 150 mM NaCl und 100mM Histidin. Das daraus resultierende Eluat wurde gegen 20 mM Bis-Tris/HCl,pH 6,8, bei 4°C über Nacht dialysiert. Anschließendwurde die QC weiter gereinigt durch Anionenaustauschchromatographieauf einer Mono Q6 Säule (BioRad), äquilibriertmit Dialysepuffer. Die QC-haltige Fraktion wurde auf die Säuleaufgetragen mit einer Fließgeschwindkeit von 4 ml/min.Die Säule wurde dann mit Äquilibrierungspuffer,enthaltend 100 mM NaCl gewaschen. Die Elution wurde mit zwei Gradienten durchgeführt,und resultierend mit 30 Säulenvolumen und 5 Säulenvolumenvon einem Äquilibrierungspuffer, enthaltend 240 mM bzw.360 mM NaCl. 6 ml Fraktionen wurden gesammelt und die Reinheit wurdedurch SDS-PAGE analysiert. Fraktionen, enthaltend homogene QC, wurdenzusammengefasst und durch Ultrafiltration konzentriert. Fürdie Langzeitlagerung (–20°C), wurde Glycerol zueiner Endkonzentration von 50% zugefügt. Protein wurdegemäß dem Verfahren von Bradford oder Gill undvon Hippel (Bradford, M. M. 1976 Anal Biochem 72, 248-254; Gill,S. C. und von Hippel, P. H. 1989 Anal Biochem 182, 319-326.)quantifiziert.
Expression und Reinigung von QC in E.coliDasKonstrukt, das für QC codiert, wurde transformiert in M15-Zellen(Qiagen) und auf selektiven LB Agarplatten bei 37°C wachsengelassen. Die Proteinexpression wurde in LB-Medium, enthaltend 1%Glucose und 1% Ethanol, bei Raumtemperatur durchgeführt.Wenn die Kultur einen OD600 von etwa 0,8erreichte, wurde die Expression mit mit 0,1 mM IPTG überNacht induziert. Nach einem Zyklus von Einfrieren und Auftauen wurdendie Zellen bei 4°C durch Zugabe von 2,5 mg/ml Lysozym in50 mM Phosphatpuffer, pH 8,0, enthaltend 300 mM NaCl und 2 mM Histidin,für etwa 30 min. lysiert. Die Lösung wurde geklärtdurch Zentrifugation bei 37000 × g, 4°C für30 min, gefolgt von einer Filtration unter Anwendung einer Glasfritte(DNA-Trennung) und zwei weiteren Filtrationsschritten unter Anwendungvon Cellulosefiltern für Rohpräzipitate und feinePräzipitate. Der Überstand (etwa 500 ml) wurdeaufgetragen auf eine Ni2+-Affinitätssäule(1,6 × 20 cm) bei einer Fließgeschwindigkeit von1 ml/min. Die Elution der QC wurde ausgeführt mit 50 mMPhosphatpuffer, enthaltend 150 mM NaCl und 100 mM Histidin. DieQC-haltige Fraktion wurde durch Ultrafiltration konzentriert.
Reinigung von QC aus Papay LatexQCaus Papaya Latex wurde hergestellt unter Verwendung des BioCAD 700E(Perseptive Biosystems, Wiesbaden, Deutschland) mit einer modifiziertenVersion eines bereits berichteten Verfahrens (Zerhouni,S. et al. 1989 Biochim Biophys Acta 138, 275-290). 50 gLatex wurde in Wasser gelöst und zentrifugiert, wie darin beschrieben.Die Inaktivierung der Proteasen wurde durchgeführt mitS-Methylmethanthiosulfonat und der daraus resultierende Rohextraktwurde dialysiert. Nach der Dialyse wurde der gesamte Überstandgeladen auf eine (21 × 2,5 cm i. d.) SP Sepharose FastFlow Säule, äquilibriert mit 100 mM Natriumacetatpuffer,pH 5,0 (Fließgeschwindigkeit 3 ml/min). Die Elution wurdedurchgeführt in drei Schritten durch die Erhöhungder Konzentration des Natriumacetatpuffers bei einer Fließgeschwindigkeitvon 2 ml/min. Der erste Schritt war ein linearer Gradient von 0,1bis 0,5 M Acetatpuffer in 0,5 Säulenvolumen. Der zweiteSchritt war eine lineare Erhöhung der Pufferkonzentrationvon 0,5 auf 0,68 M in vier Säulenvolumen. Währenddes letzten Elutionsschritts wurde ein Säulenvolumen mit0,85 M Puffer aufgetragen. Fraktionen (6 ml), enthaltend die höchsteenzymatische Aktivität wurden zusammen gefasst. Die Konzentrationund Pufferänderungen zu 0,02 M Tris/HCl, pH 8,0 wurdenmittels Ultrafiltration (Amicon; Molekulargewichtsgrenze (cut-off)der Membran 10 kDa) durchgeführt.
Ammoniumsulfatwurde zu einer Endkonzentration von 2 M zugefügt zu demkonzentrierten Papaya Enzym, erhalten aus dem Ionenaustauschchromatographie-Schritt.Diese Lösung wurde aufgetragen auf eine (21 × 2,5cm i. d.) Butyl Sepharose 4 Fast Flow Säule (Fließgeschwindigkeit1,3 ml/min), äquilibriert mit 2 M Ammoniumsulfat, 0,02M Tris/HCl, pH 8,0. Die Elution wurde in drei Schritten mit abnehmendenKonzentrationen von Ammoniumsulfat durchgeführt. Währenddes ersten Schritts wurde ein linearer Gradient von 2 bis 0,6 MAmmoniumsulfat, 0,02 M Tris/HCl, pH 8,0 angewandt für 0,5Säulenvolumen bei einer Fließgeschwindigkeit von1,3 ml/min. Der zweite Schritt war ein linearer Gradient von 0,6bis 0 M Ammoniumsulfat, 0,02 M Tris/HCl, pH 8,0, in 5 Säulenvolumenbei einer Fließgeschwindigkeit von 1,5 ml/min. Der letzteElutionsschritt wurde ausgeführt durch Auftragung von 2Säulenvolumen 0,02 M Tris/HCl bei pH 8,0 bei einer Fließgeschwindigkeitvon 1,5 ml/min. Alle Fraktionen, die QC-Aktivität enthielten,wurden vereinigt und durch Ultrafiltration konzentriert. Die resultierendehomogene QC wurde bei –70°C gelagert. Die Endkonzentrationendes Proteins wurden ermittelt nach dem Verfahren von Bradford, imVergleich zu einer Standardkurve, erhalten mit Rinderserumalbumin.
Beispiel 2: Assays für Glutaminyl-CyclaseAktivitätFluorometrische AssaysAlleMessungen wurden bei 30°C durchgeführt mit einemBioassay Reader HTS-7000 Plus für Mikrotiterplatten (PerkinElmer). QC-Aktivität wurde fluorometrisch bewertet unterVerwendung von H-Gln-βNA. Die Proben bestanden aus 0,2mM fluorogenem Substrat, 0,25 U Pyroglutamyl-Aminopeptidase (Unizyme, Hørsholm,Dänemark) in 0,2 M Tris/HCl, pH 8,0, enthaltend 20 mM EDTAund ein entsprechend verdünntes Aliquot von QC in einemEndvolumen von 250 μl. Anregungs-/Emissionswellenlängenwaren 320/410 nm. Die Assay-Reaktionen wurden durch Zugabe von Glutaminylcyclasegestartet. Die QC-Aktivität wurde bestimmt aus einer Standardkurvevon β-Naphthylamin unter Assay-Bedingungen. Eine Einheitwird definiert als die Menge von QC, die die Bildung von 1 μmolpGlu-βNA aus H-Gln-βNA pro Minute unter den beschriebenenBedingungen katalysiert.
Ineinem zweiten fluorometrischen Assay wurde die QC-Aktivitätunter Verwendung von H-Gln-AMC als Substrat bestimmt. Die Reaktionenwurden bei 30°C unter Nutzung des Novostar Reader fürMikrotiterplatten (BMG labtechnologies) durchgeführt. DieProben bestanden aus unterschiedlichen Konzentrationen des fluorogenenSubstrats, 0,1 U Pyroglutamyl-Aminopeptidase (Qiagen) in 0,05 MTris/HCl, pH 8,0, enthaltend 5 mM EDTA und ein geeignet verdünntesAliquot von QC in einem Endvolumen von 250 μl. Anregungs-/Emissionswellenlängenwaren 380/460 nm. Die Assay-Reaktionen wurden durch Zugabe von Glutaminylcyclasegestartet. QC-Aktivität wurde aus einer Standardkurve von7-Amino-4-methylcumarin unter Assay-Bedingungen bestimmt. Die kinetischenDaten wurden unter Verwendung der Software GraFit ausgewertet.
Spektrophotometrischer Assay fürQCDieserneue Assay wurde verwendet, um die kinetischen Parameter fürdie meisten Substrate von QC zu bestimmen. QC-Aktivitätwurde spektrophotometrisch analysiert unter Verwendung von einemkontinuierlichen Verfahren, das erhalten wurde, indem ein frühererdiskontinuierlicher Assay (Bateman, R. C. J. 1989 J NeurosciMethods 30, 23-28), der Glutamatdehydrogenase als Hilfsenzymverwendet, angepasst wurde. Die Proben bestanden aus dem jeweiligenQC-Substrat, 0,3 mM NADH, 14 mM α-Ketoglutarsäureund 30 U/ml Glutamatdehydrogenase in einem Endvolumen von 250 μl.Die Reaktionen wurden durch Zugabe von QC gestartet und verfolgtdurch Beobachtung der Abnahme der Absorption bei 340 nm für8–15 min. Typische Zeitverläufe der Produktbildungsind in 1 dargestellt.
DieAnfangsgeschwindigkeiten wurden ausgewertet und die enzymatischeAktivität wurde aus einer Standardkurve von Ammoniak unterAssay-Bedingungen bestimmt. Alle Proben wurden bei 30°Cgemessen, entweder unter Verwendung des SPECTRAFluor Plus oder desSunrise (beide von TECAN) Reader für Mikrotiterplatten.Die kinetische Daten wurden unter Verwendung der Software GraFitausgewertet.
Inhibitor-AssayZumTest eines Inhibitors war die Probenzusammensetzung die gleiche,wie vorstehend beschrieben, mit der Ausnahme, dass die vermeintlichhemmende Inhibitorverbindung zugefügt wurde. Füreinen schnellen Test der QC-Hemmung enthielten die Proben 4 mM desjeweiligen Inhibitors und eine Substratkonzentration von 1 KM. Für detaillierte Untersuchungender Hemmung und die Bestimmung von Ki-Werten,wurde zuerst der Einfluss des Inhibitors auf die Hilfsenzyme untersucht.In allen Fällen wurde kein Einfluss auf das jeweilige Enzymbeobachtet, und somit war eine zuverlässige Bestimmungder QC-Hemmung möglich. Die Inhibitorkonstante wurde ausgewertet,indem der Satz von Verlaufskurven an die allgemeine Gleichung fürkompetitive Hemmung unter Verwendung von der Software GraFit angepasstwurde.
Beispiel 3: MALDI-TOF MassenspektrometrieMatrix-unterstützteLaser-Desorption/Ionisation (Matrix-assisted Laser Desorption/Ionisation,MALDI) Massenspektrometrie wurde ausgeführt unter Verwendungdes Hewlett-Packard G2025 LD-TOF Systems mit einem linearen Flugzeit-Analysator(time of flight analyzer). Das Instrument wurde ausgerüstetmit einem 337 nm Stickstoff-Laser, einer Ionenbeschleunigerquelle(potential acceleration source) (5 kV) und einer 1,0 m Flugöhre.Der Detektorbetrieb erfolgte im Positiv-Ionenmodus und die Signalewurden aufgezeichnet und gefiltert unter Verwendung eines LeCroy9350M digitalen Speicheroszilloskops, das mit einem PC verbunden war.Die Proben (5 μl) wurden mit gleichen Volumen der Matrixlösunggemischt. Für die Matrixlösung verwendeten wirDHAP/DAHC, hergestellt, indem 30 mg 2,6-Dihydroxyacetophenon (Aldrich)und 44 mg Diammoniumhydrogencitrat (Fluka) in 1 ml Acetonitril/0,1%TFA in Wasser (1/1, v/v) gelöst wurden. Ein kleines Volumen (1 μl)der Matrix-Analyt-Mischung wurde zu einer Sondenspitze überführtund sofort in einer Vakuumkammer verdampft (Hewlett-Packard G2024AProbenvorbereitungszubehör), um eine schnelle und homogeneProbenkristallisation zu gewährleisten.
Fürdie Langzeituntersuchungen der Glu1-Cyclisierungwurden Aβ-abgeleitete Peptide in 100 μl 0,1 M Natriumacetatpuffer,pH 5,2 oder 0,1 M Bis-Tris Puffer, pH 6,5 bei 30°C inkubiert.Die Peptide wurden aufgetragen in Konzentrationen von 0,5 mM [Aβ3-11a]oder 0,15 mM [Aβ3-21a] und 0,2 U QC wurde alle 24 Stunden hinzugefügt.Im Fall von Aβ3-21a enthielten die Assays 1% DMSO. Zu verschiedenenZeiten wurden die Proben aus dem Assay-Röhrchen entnommen,die Peptide unter Verwendung von ZipTips (Millipore) nach Angabendes Herstellers extrahiert, mit Matrixlösung (1:1 v/v)gemischt und anschließend die Massenspektren aufgenommen.Negativkontrollen enthielten entweder kein QC oder Hitze deaktiviertesEnzym. Für die Inhibitoruntersuchungen war die Probenzusammensetzungdie gleiche, wie oben beschrieben, mit der Ausnahme, dass die hemmendeVerbindung zugefügt war (5 mM Benzimidazol oder 2 mM 1,10-Phenanthrolin).
Beispiel 4: pH-AbhängigkeitDiepH-Abhängigkeit der Katalyse von humaner und Papaya QCwurde untersucht unter Geschwindigkeitsbedingungen 1. Ordnung, umdadurch die Auswirkungen der Protonenkonzentration auf die Spezifitätskonstantekcat/KM wiederzugeben.Zu diesem Zweck wurde der gekoppelte Enzymassay unter Verwendung vonPyroglutamyl-Aminopeptidase als Hilfsenzym und Gln-βNAals Substrat verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass Pyroglutamyl-Aminopeptidaseaktiv und stabil zwischen pH 5,5–8,5 ist (Tsuru,D. et al. 1978 J Biochem (Tokyo) 84, 467-476). Somit ermöglichteder Assay die Untersuchung der QC-Katalyse in diesem pH-Bereich.Die erhaltenen Geschwindigkeitsprofile wurden an klassische glockenförmigeKurven angepasst, wie in 2 gezeigt. Die humane QC zeigteine sehr enge pH-Abhängigkeit mit einem Optimum bei etwapH 7,8–8,0. Bei basischerem pH tendierte die Geschwindigkeitdazu, sich zu verringern. Dies steht im Gegensatz zu dem fürPapaya QC beobachteten Geschwindigkeitsprofil, das keinen Rückgangder Aktivität bis pH 8,5 zeigte (2, Einschub).Allerdings hatten beide Enzyme ihre optimale Spezifitätbei pH 8. Überraschenderweise offenbarte die Auswertungder Kurven identische PKa-Werte im saurenBereich von 7,17 ± 0,02 und 7,15 ± 0.02 fürhumane bzw. Papaya QC.
DieAbnahme der Aktivität der humanen QC bei basischen pH-Wertenwar offensichtlich bedingt durch die Dissoziation einer Gruppe miteinem pKa von etwa 8,5. Im Fall von PapayaQC war keine übermäßige Datenpunktsammlungim basischen pH-Bereich möglich, um eine zuverlässigeBestimmung des zweiten pKa-Wertes zu ermöglichen.Dies wird gestützt durch die Anpassung der Daten an einEinzeldissoziationsmodell, das in einem nahezu identischen pKa-Wert (pKa 7,13 ± 0,03)resultiert, verglichen mit einer Anpassung der Daten an ein Zweifachdisssoziationsmodell.Dies deutet darauf hin, dass beide pKa-Werteziemlich getrennt sind.
pH-StabilitätDieStabilität der Glutaminyl-Cyclasen wurde untersucht, indemdie pflanzlichen und tierischen Enzyme bei 30°C für30 min bei unterschiedlichen pH-Werten zwischen pH 4–10inkubiert wurden. Danach wurde die QC-Aktivität unter Standardbedingungenbestimmt. Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt.
DieQC aus Papaya Latex war stabil im untersuchten pH-Bereich, ohneeine offensichtliche Tendenz für eine Instabilitätim sauren oder basischen Bereich. Im Gegensatz dazu zeigte die humaneQC nur eine vergleichbare Stabilität im pH-Bereich zwischen7 und 8,5, was eine bemerkenswerte Instabilität bei pH-Werten oberhalbvon pH 8,5 und unterhalb von 6 anzeigt. Somit scheint der Bereichum pH 8 optimal zu sein für die Aktivität unddie Stabilität der pflanzlichen und humanen QC, und eingeeigneter pH-Wert für die Durchführung einesVergleichs der Substratspezifität der QCs.
Beispiel 5: Bestimmung der Substratspezifitätvon QCSpektrophotometrischer AssayDerkontinuierliche spektrophotometrische Assay wurde durchgeführtwie in Beispiel 2 beschrieben. Entsprechend wird die QC-Aktivitätdurch eine Abnahme der Absorption bei 340 nm wieder gespiegelt,verursacht durch die Freisetzung von Ammoniak und anschließendemVerbrauch von NADH/H+ auf Grund der Bildungvon Glutamat aus α-Ketoglutarsäure. Wie in 1 gezeigt,wurden lineare Verlaufskurven beobachtet und es gab eine lineareBeziehung zwischen der gemessenen Aktivität und der Konzentrationder QC. Darüber hinaus waren die kinetischen Parameter,erhalten für H-Gln-Gln-OH unter Verwendung des hierin präsentiertenkontinuierlichen Assay (Tabelle 1), in guter Übereinstimmungmit den Ergebnissen, erhalten unter Verwendung des diskontinuierlichenAssay (KM = 175 ± 18 μM,kcat = 21.3 ± 0.6 s–1).Darüber hinaus sind die in Tabelle 1 gezeigten kinetischenParameter für die Umwandlung der Substrate H-Gln-Ala-OH,H-Gln-Glu-OH, H-Gln-Gln-OH, H-Gln-OtBu und H-Gln-NH2 durchPapaya QC in guter Übereinstimmung mit denen, die unter Verwendungeines direkten Verfahrens bei pH 8,8 und 37°C bestimmtwurden (Gololobov, M. Y. et al. 1996 Biol Chem Hoppe Seyler377, 395-398). Damit ist es ziemlich offensichtlich, dassder neue kontinuierliche Assay zuverlässige Ergebnisseliefert.
Di-, Tri- und Dipeptid-SurrogateUnterVerwendung des neuen vorstehend beschriebenen kontinuierlichen Assaywurden etwa 30 Verbindungen als mögliche Substrate vonQC aus C. papaya und humaner QC getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle5 dargestellt. Durch Vergleich der Spezifitäten wurde gezeigt,dass nahezu alle kurzen Peptidsubstrate effizienter durch PapayaQC umgewandelt wurden, im zu dem humanen Enzym. Interessant ist,dass für beide Enzyme Substrate mit großen hydrophobenResten an der Position zwei die wirksamsten Substrate sind, wie gezeigtdurch die Spezifitäten für H-Gln-Tyr-Ala-OH, H-Gln-Phe-Ala-NH2 und H-Gln-Trp-Ala-NH2 imVergleich zu denen anderer Tripeptide oder den Reaktivitätender chromophoren Substrate H-Gln-AMC, H-Gln-βNA und H-Gln-Tyr-OHim Vergleich zu Dipeptidsubstraten. Für Papaya QC stehtdiese Feststellung im Einklang mit früheren Ergebnissen,die zeigen, dass die Spezifität mit der Größedes zweiten Aminosäurerestes korreliert (Gololobov,M. Y. et al. 1996 Biol Chem Hoppe Seyler 377, 395-398).Der einzige auffallende Unterschied in der Spezifität derpflanzlichen und tierischen QC wurde im Fall von H-Gln-OtBu beobachtet.Während der Ester von Papaya QC mit ähnlicherSpezifität im Vergleich zu Dipeptidsubstraten umgewandeltwurde, wurde er etwa um eine Größenordnung langsamerdurch humane QC umgewandelt.
OligopeptideNebenmehreren Dipeptiden und Tripeptiden wurde eine Reihe von Oligopeptidengetestet auf die Umwandlung durch Papaya QC und humane QC (Tabelle5). Interessant ist, dass im Ganzen der Unterschied in den Spezifitätenzwischen humaner und pflanzlicher QC für eine Reihe vonTetrapeptiden nicht so groß war, wie er für Dipeptid-und Tripeptidsubstraten beobachtet wurde. Dies deutet darauf hin,dass die Aminosäuren an Position 3 und 4 noch Einflussauf das kinetische Verhalten haben, vor allem bei humaner QC. EineAusnahme stellen jedoch die Peptide mit einem Prolinrest an derPosition der zweiten Aminosäure dar, die deutlich verringertekcat/KM-Werte ineiner Reihe von Tetrapeptiden mit der Struktur H-Gin-Xaa-Tyr-Phe-NH2 zeigen (Tabelle 5). Die Verringerung derSpezifität war ausgeprägter für humaneQC, was zu einem etwa 8-fachen Unterschied bei den kcat/KM-Werten, verglichen mit Papaya QC, führt.
Leichtverringerte Spezifitäten der humanen QC wurden auch fürdie Umwandlung von Substraten mit einer positiv geladenen AminosäureC-terminal zu Glutamin beobachtet, wie angezeigt durch die Spezifitäten fürH-Gln-Arg-Tyr-Phe-NH2, H-Gln-Arg-Tyr-Phe-NH2 und H-Gln-Lys-Arg-Leu-NH2 imVergleich zu anderen Tetrapeptiden. Offenbar war die verringerteSpezifität vor allem auf einen geringere Umsatzzahl (turnovernumber) zurück zu führen. Dieser Effekt trat imFall des pflanzlichen Enzyms nicht auf.
Tabelle5: Kinetische Auswertung von Peptidsubstraten der humanen und PapayaQC (n. r., nicht reaktiv; n. i., keine Hemmung; n. d., nicht bestimmt;*, für Substrathemmung)
Diemit den Tetrapeptiden erzielten Ergebnisse lassen auch eine andereSchlussfolgerung zu. Wie bereits erwähnt, zeigte PapayaQC eine höhere Selektivität für Dipeptide.Für einige der Tetrapeptide wurden jedoch höhereSpezifitätskonstanten mit der humanen QC beobachtet, wiein 4 gezeigt, die eine graphische Darstellung derin Tabelle 5 angegeben Daten bereit stellt, für eine Reihevon Peptiden, die Glutamat an der zweiten Aminosäurepositionenthalten. Weiterhin nimmt die Selektivität der humanenQC mit steigender Kettenlänge von Di- zu Tetrapeptidenzu, im Gegensatz zu den Ergebnissen die mit Papaya QC erhalten wurden. Darüberhinaus wurde die höchste Selektivität der humanenQC für die Peptide aufgezeichnet, die einen sperrigen hydrophobenRest an der 3. und 4. Aminosäureposition enthalten, wasauf hydrophobe Wechselwirkungen mit dem Enzym hindeutet. Durch denVergleich der kinetischen Parameter für die jeweiligenPeptide scheinen die Änderungen vor allem auf die niedrigerenKM-Werte zurück zu führenzu sein, für die Umsatzzahlen für die Umwandlungder Peptide wurde festgestellt, dass sie ähnlich sind.Somit wird angenommen, dass die höhere Selektivitätder humanen QC für längere Peptide das Ergebniseiner festeren Bindung des hydrophoberen Substrates an das Enzymist.
DieUnterschiede zwischen humaner und pflanzlicher QC, beobachtet mitPeptiden, die hydrophobe Aminosäuren an der 3. und 4. Positionentahlten, wird auch deutlich durch einen Vergleich der Spezifitätskonstantender Enzyme gegenüber H-Gln-Gly-Arg-Ile-NH2 undH-Gln-Arg-Tyr-Phe-NH2 oder H-Gln-Gln-OHund H-Gln-Gln-Tyr-Phe-OH.
Fürhumane QC wurde auch gefunden, dass sie selektiver fürhomologe Substrate ist, die N-terminal Gln und eine wachsende Zahlvon C-terminalen Ala Resten enthalten (Tabelle 6). Währenddie Selektivität der humanen QC mit der Substratlängesteigt, gab es keinen solche Tendenz bei der Papaya QC. Da die humane QCweniger spezifisch für ein Peptid mit einem Ser Rest inder Sequenz war, scheint auch die Art der Seitenkette von Bedeutungzu sein (Tabelle 6).
Tabelle6: Einfluss der Substratlänge auf die Aktivitätvon humaner und Papaya QC
Einweiterer Parameter, der im Hinblick auf seinen Einfluss auf dieSubstratspezifität untersucht wurde, war die Ionenstärke.Zu diesem Zweck wurden die kinetischen Parameter für dieCyclisierung von mehreren Substraten in Gegenwart und Abwesenheitvon 0,5 M KCl bestimmt (Tabelle 7). Überraschenderweise änderte sichim Fall der QC aus Papaya Latex und humaner QC die Selektivitätfür Substrate mit ungeladenem Rückgrat nicht wesentlichdurch Zugabe von Salz. Die Spezifitätskonstanten der humanenQC für H-Gln-Ala-OH und H-Gln-Glu-OH nahmen durch die Zugabevon KCl jedoch ab. Wie durch die individuellen kinetischen Parameterangedeutet, war dieser Effekt auf eine Zunahme von KM undeine nur leichte Abnehme des kcat-Wertes zurückzu führen. Im Fall von Papaya QC gab es keinen Effekt aufeinen der bestimmten Parameter. Der Effekt schien nicht auf dasnegativ geladene Substrat als solches zurück zu führensein, da unveränderte Parameter für das negativgeladene Peptid H-Gln-Glu-Asp-Leu-NH2 gefundenwurden. Ein interessanter Effekt der Salzzugabe wurde fürdie positiv geladenen Substrate H-Gln-Gly-Arg-Ile-NH2 undH-Gln-Lys-Arg-Leu-NH2 gefunden. Im Fallvon pflanzlicher und humaner QC wurde ein positiver Effekt auf dieKatalyse bestimmt, hauptsächlich auf Grund eines geringerenKM-Wertes und einer leicht höherenUmsatzzahl.
Tabelle7: Einfluss der Ionenstärke auf die Katalyse von humanerund Papaya QC
Infrüheren Studien wurde die Umwandlung von [Gln1]-TRHund [Gln1]-GnRH durch QC bereits gezeigt fürdie QC aus Rinder- und Schweine-Hypophyse (Busby, W. H.J. et al. 1987 J Biol Chem. 262, 8532-8536; Fischer,W. H. und Spiess, J. 1987 Proc Natl Acad Sci USA 84, 3628-3632).Zusätzlich zu diesen bereits untersuchten Hypophysenhormonenwurden drei mögliche physiologische Substrate der humanenQC synthetisiert und die auf Umwandlung getestet, nämlich[Gln1]Gastrin, [Gln1]Neurotensinund [Gln1]FPP. Die kinetischen Parameterfür ihre Umwandlung sind in Tabelle 1 aufgeführt.Interessanterweise werden die Glutaminyl-Peptide zu den jeweiligenPyroglutamyl-Peptiden umgewandelt mit zunehmenden Spezifitätskonstantenin Abhängigkeit von ihrer Größe, d. h.Zuerst das größte Peptid pro-Gastrin mit 17 Aminosäuren,gefolgt von pro-Neurotensin, pro-GnRH, Pro-TRH und pro-FPP. DieseFeststellungen entsprechen den Daten, die mit den synthetischenPeptiden erhalten wurden.
Überraschenderweisewerden auch die längeren Substrate mit höhererSelektivität durch das pflanzliche Enzym umgewandelt, einErgebnis, das zum Teil den Ergebnissen für die kürzerenOligopeptide widerspricht. Möglicherweise gibt es weitvom aktiven Zentrum entfernte sekundäre Bindungswechselwirkungen zwischenSubstrat und Enzym.
Peptide mit modifizierten AminosäurenUmdie Spezifität und Selektivität der QCs weiterzu untersuchen, wurden Peptide synthetisiert, die entweder einenmodifizierten N-terminalen Glutaminylrest oder eine modifizierteAminosäure an der Position 2 enthalten. Die Umwandlungdieser Peptide wurde qualitativ unter Verwendung von MALDI-TOF Massenspektrometrieuntersucht (siehe auch Beispiel 3). Auf Grund der Cyclisierung desGlutaminylrestes bzw. seinem Analogon wird für das Substratund das Produkt der Katalyse eine Massendifferenz erkannt; ein Molpro Mol Substrat in Fällen der Freisetzung von Ammoniak.Die Umwandlung wurde auch quantitativ unter Verwendung von dem spektrophotometrischenAssay analysiert.
H-Gln-Lys(Gln)-Arg-Leu-Ala-NH2. Dieses N-terminal verzweigte Peptid, daszwei Glutaminylreste am N-Terminus enthält, die via einerPeptid- und partiellen Isopeptidbindung an einen Lysylrest gebundensind, wurde durch humane QC (5) und PapayaQC (nicht dargestellt) auf scheinbar identische Art umgewandelt. BeideGlutaminylreste wurden in Pyroglutaminsäure umgewandelt,ohne irgendeine nachweisbare Präferenz für einenbestimmten Rest, wie angezeigt durch die konsistente Substratumwandlung(5). Somit unterscheidet sich die Selektivitätder QCs für die unterschiedlich gebundenen Glutaminylrestenicht grundlegend.
H-Gln(NMe)-Phe-Lys-Ala-Glu-NH2. Der methylierte Glutaminylrest wurde nurvon Papaya QC in einen Pyroglutamylrest umgewandelt (6).Darüber hinaus wurde keine Hemmung der humanen QC durchdas Peptid beobachtet, was darauf hinweist, dass der methylierteRest von humaner QC nicht erkannt wird.
H-Glu(OMe)-βNAund H-Glu-βNA. Keine dieser Verbindungen wurde durch PapayaQC oder humane QC umgewandelt. Diese fluorogenen Substrate wurdenfluorometrisch analysiert unter Verwendung von Pyroglutamyl-Aminopeptidaseals Hilfsenzym. Der O-methylierte Glutamatrest zeigte jedoch einebemerkenswerte Instabilität sowohl in Tris- als auch inTricin-Puffer, mit der Tendenz zu einer nicht-enzymatisch katalysierten Cyclisierung.Weiterhin wurde die Aktivität von beiden QCs gegenüberH-Gln-AMC als Substrat nicht durch die längeren PeptideH-Glu(OMe)-Phe-Lys-Arg-Ala-Leu-NH2 oderH-Glu-Phe-Lys-Arg-Ala-Leu-NH2 gehemmt, wasdarauf hinweist, dass Glutaminsäure oder Derivate von beidenQC Formen nicht erkannt werden. Außerdem impliziert dasErgebnis, dass nicht nur die negative Ladung des Glutaminsäurerestesder Grund für die Verdrängung des Peptids ausdem aktiven Zentrum ist.
H-Gln-cyclo(Nε-Lys-Arg-Pro-Ala-Gly-Phe).Die Umwandlung von H-Gln-cyclo(Nε-Lys-Arg-Pro-Ala-Gly-Phe),welches eine partielle intramolekulare Isopeptidbindung enthält,wurde quantitativ analysiert, wobei ein KM-Wertvon 240 ± 14 μM und 133 ± 5 μMfür humane bzw. Papaya QC ermittelt wurde. Auf Grund derhöheren Umwandlungszahl für die Umwandlung durchPapaya QC (49,4 ± 0,6 s–1)im Vergleich zu humaner QC (22,8 ± 0,6 s–1),zeigt das pflanzliche Enzym mit 372 ± 9 mM–1min–1 einen etwa 4-fach höherenkcat/KM-Wert alsdie humane QC. Somit ist die Spezifitätskonstante im Fallder Papaya QC nur leicht niedriger im Vergleich zu Substraten miteiner ähnlichen Größe, wie z. B. H-Gin-Ala-Ala-Ser-Ala-Ala-NH2. Der mit 95 ± 3 mM–1s–1 ermittelte kcat/KM-Wert für humane QC war jedochetwa eine Größenordnung kleiner bei Vergleichmit Substraten ähnlicher Größe (Tabelle5).
H-βhomoGln-Phe-Lys-Arg-Leu-Ala-NH2. Der N-terminale β-Homoglutaminylrestwurde durch Katalyse mit humaner bzw. Papaya QC in einen fünfgliedrigenLactamring umgewandelt. Die gleichzeitige Freisetzung von Ammoniakwurde spektrophotometrisch und mittels MALDI-TOF Analyse, wie zuvorbeschrieben, analysiert. Es wurde keine Freisetzung von Ammoniakbeobachtet, wenn QC weggelassen oder gekocht wurde, was auf einespezifische Katalyse der Cyclisierung anzeigt. Interessanterweisekatalysieren die QC aus C. papaya (KM =3,1 ± 0,3 mM, kcat = 4,0 ± 0,4s–1) und humane QC (KM =2,5 ± 0,2 mM, kcat = 3,5 ± 0,1s–1) die Umwandlung dieses Peptidsmit nahezu identischen kcat/KM-Wertenvon 1,4 ± 0,1 bzw. 1,3 ± 0,1 mM–1s–1. Somit wird die Cyclisierungdes β-Homoglutaminrestes mit einer etwa 1000-fach geringerenEffizienz katalysiert im Vergleich zu Peptiden ähnlicherGröße, die einen Glutaminylrest an ihrem N-Terminusenthalten. Dies zeigt, dass die Konstitution des α-Kohlenstoffsdes Substrats wichtig für die Substraterkennung durch dieQC Formen ist, aber nicht essentiell. Die essentielle Voraussetzung,um ein Substrat zu sein, ist eine γ-Amidgruppe und eineunprotonierte N-terminale Aminogruppe in einem zur Cyclisierungneigenden Abstand und Winkel, eine Voraussetzung, die von N-terminalenGlutaminyl- und Homoglutaminylresten erfüllt wird.
Beispiel 6: Synthese der QC-SubstrateOligopeptide.Peptide wurden halbautomatisch in einem 0,5 mmol Maßstabsynthetisiert unter Verwendung von einem Peptidsynthesizer (LabortecSP650, Bachem, Schweiz), wie zuvor beschrieben (Schilling, S.et al. 2002 Biochemistry 41, 10849-10857). LängerePeptide wurden in einem 25 μmol Maßstab synthetisiert unterVerwendung des automatischen Symphony Peptidsynthesizer (RaininInstrument Co.), wie beschrieben (Manhart, S. et al. 2003Biochemistry 42, 3081-3088). Für alle Peptidkupplungenwurden modifizierte Fmoc-Protokolle für die FestphasenPeptidsynthese eingesetzt unter Verwendung von 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborat(TBTU; Novabiochem)/Base (Diisopropylethylamin oder N-Methylmorpholin,Merck) oder im Fall von schwierigen Kupplungen wurde N-[(Dimethylamino)-1H-1,2,3,-triazolo[4,5-b]pyridin-1-ylmethylen]-N-methylmethanamminiumhexafluorphosphat N-oxid (4,5) (HATU; Applied Biosystems)/Diisopropylethylaminals Aktivierungsreagenz verwendet. Nach Abspaltung vom Harz mitTrifluoressigsäure (TFA, Merck)-enthaltendem Cocktail,wurde das rohe Peptid durch präparative HPLC mit säurefreienLösungsmitteln gereinigt, um eine weitere Cyclisierungdes N-terminalen Glutamins zu vermeiden. Präparative HPLCwurde durchgeführt mit einem linearen Gradienten aus Acetonitril(Merck) in Wasser (5–40% oder 65% Acetonitril über40 min) auf einer 250-21 Luna RP18 Säule (Phenomenex).Zur Bestätigung der Peptidreinheit und Identitätwurden eine analytische HPLC und ESI-MS eingesetzt.
Glu(NH-NH2)-Ser-Pro-Thr-Ala-NH2.Das lineare Vorläuferpeptid (Fmoc-Glu-Ser-Pro-Thr-Ala-NH2) wurde nach Fmoc-Standardverfahren synthetisiert(Schilling, S. et al. 2002 Biochemistry 41, 10849-10857)an einem Rink Amid MBHA Harz (Novabiochem). Nach Abspaltung desFmoc-geschützten Peptids vom Harz wurde das Peptid mitDiethylether (Merck) präzipitiert, filtriert und getrocknet.HMBA-AM Harz (1,16 mmol/g, Novabiochem) wurde verwendet fürdie Kupplung der γ-Carboxylsäuregruppe der Glutaminsäuredes Vorläuferpeptid (3 Äq.) in Dichlormethan (DCM,Merck). Dicyclohexylcarbodiimid (DCC, Serva) (4 Äq.) undDimethylaminopyridin (DMAP, Aldrich) (0,1 Äq) wurden alsKupplungsreagenzien verwendet. Nach 12 Stunden wurde das Harz filtriert,mit DCM gewaschen und die Reaktion wurde wiederholt. Nach der Entschützungder N-terminalen Fmoc-Gruppe durch den Einsatz von 20% Piperidinin DMF (3 × 5 min) wurde das Peptidharz für 1,5 Stundenmit einer 5%-igen Hydrazinlösung (20 ml/g) behandelt. DasHarz wurde filtriert und mit Dimethylformamid (DMF, Roth, Deutschland)und TFA gewaschen. Nach Evaporation wurde das Rohpeptid mit Etherpräzipitiert, die Ausbeute betrug 76%.
H-Gln-Lys(Gln)Arg-Leu-Ala-NH2. Das lineare Peptid wurde synthetisiertnach dem Fmoc/tBu-Standardverfahren an RinkAmid MBHA (Schilling, S. et al. 2002 Biochemistry 41, 10849-10857)unter Verwendung von Fmoc-Lys(Fmoc)-OH als vorletzte Aminosäurekupplung.Nach der Entschützung der beiden Aminoschutzgruppen vonLysin mit 20% Piperidin (Merck) in DMF, wurden 4 Äq. Fmoc-Gln(Trt)-OHgekuppelt. Standardabspaltungsverfahren ergaben eine 95% Ausbeute.
H-Gln(NMe)-Phe-Lys-Ala-Glu-NH2. Fmoc-Gln(NMe)-OH wurde synthetisiert ausgehendvon Fmoc-Glu-OtBu geladen an Fmoc-MI-AM (Novabiochem) Harz. NachSchwellung mit DCM wurde das Harz (0,5 g) mit DMF gewaschen mitDMF und entschützt mit einer 20%igen Piperidinlösungin DMF. Das Harz wurde in 5 ml DMF gegeben und 5 Äq. Fmoc-Glu-OtBu,5 Äq. HATU und 10 Äq. DIPEA wurden anschließendzugegeben und für 6 Stunden geschüttelt. NachFiltration und Waschen wurde das Produkt abgespalten gemäß Standardbedingungenbei der Spaltung mit TFA. Das Peptid H-Gln(NMe)-Phe-Lys-Ala-Glu-NH2 wurde wie beschrieben synthetisiert (Schilling,S. et al. 2002 Biochemistry 41, 10849-10857). Fmoc-Gln(NMe)-OHwurde über Nacht mit HATU/DIPEA gekuppelt. Standardabspaltungsverfahrenergaben 78% des Rohpeptids.
H-Glu(OMe)-β-naphthylamid,H-Gln-Val-OH, H-Gln-Tyr-OH. Boc-geschützte Dipeptide wurdensynthetisiert durch Standardverfahren unter Anwendung von gemischtemAnhydrid, indem Isobutylchlorcarbonat (Merck) verwendet wurde. DieC-terminalen Methylester Boc-Gln-Tyr-OMe und Boc-Gln-Val-OMe wurdenverseift mit 1 N NaOH in Dioxan. Die Boc-geschützten Peptidewurden entschützt mit einer HCl/Dioxan-Lösung für10 min. Nach der Evaporation wurde der Rückstand mit mehrerenLösungsmitteln kristallisiert, was 60–70% einerfesten Verbindung ergab.
H-Gln-cyclo(Nε-Lys-Arg-Pro-Ala-Gly-Phe).Der lineare Vorläufer Boc-Gln(Trt)-Lys-Arg(Pmc)-Ala-Gly-Phe-OHwurde synthetisiert an säureempfindlichem 2-Chlortrityl-Harz.Die Kupplung wurde ausgeführt unter Verwendung von einemStandardverfahren der Fmoc/tBu-Strategieunter Verwendung von Fmoc-Lys(Mtt)-OH. Nach der Spaltung mit 3%igerTFA-Lösung in DCM (10 Mal 5 min) wurde die Lösungmit 10% Pyridin (Merck) in Methanol (MeOH, Merck) neutralisiert,3 Mal mit DCM und MeOH gewaschen, auf 5% des Volumens eingedampftund das Rohpeptid wurde mit eiskaltem Wasser präzipitiert.Im Anschluss wurde das Rohpeptid cyclisiert unter Verwendung vonDCC/N-Hydroxybenzotriazol (HOBt, Aldrich) Aktivierung. Das Rohpeptidwurde gelöst in trockenem Dichlormethan (0,2 mmol/50 ml),0,2 mmol N-Methylmorpholin und 0,4 mmol 1-Hydroxybenzotriazol wurdezugefügt. Diese Lösung wurde bei 0°Ctropfenweise zu einer Lösung von 0,4 mmol Dicyclohexylcarbodiimidin 250 ml Dichlormethan zugegeben. Die Reaktion wurde durch Rühren überNacht bei Raumtemperatur abgeschlossen. Nach Filtration mit N,N\'-Dicyclohexylharnstoff wurdedas Lösungsmittel abgedampft. Der Rückstand wurdein Ethylacetat gelöst und mehrmals gewaschen mit 1 N HCl,gesättigter Lösung von NaHCO3 undWasser. Die Lösung wurde über wasserfreiem Na2SO4 getrocknet,filtriert und im Vakuum zur Trockne eingedampft.
Beispiel 7: Charakterisierung von Effektorender QCImidazolderivateImidazol-und Benzimidazolderivate, die Substituenten an unterschiedlichenPositionen des fünfgliedrigen Rings tragen, wurden alsInhibitoren der QC getestet (Tabelle 3). Die Anordnung der Zahlenbezieht sich auf den Imidazolring. Die angewandten Verfahren sindin Beispiel 2 beschrieben.
C-4(5)und C-4,5 Derivate. Die Verbindungen, die entweder einen Substituentenan der 4- oder 5-Position des Imidazolrings, die konstitutionell äquivalentsind, tragen oder an beiden Positionen, zeigten eine verminderteWirksamkeit für die Hemmung von humaner QC. Die einzigeAusnahme betraf jedoch N-ω-acetyliertes Histamin, das sichals eine der am stärksten hemmenden Verbindungen erwies.Kleine Substituenten an diesen Positionen hatten nur einen geringenEffekt auf die Bindung, wie angezeigt durch die ähnlicheHemmkonstante von 5-Hydroxymethyl-4-methylimidazol im Vergleichzu Imidazol. Größere und sperrigere an diesen Stellenangebrachte Gruppen verminderten oder verhinderten die Bindung derVerbindung an das Enzym. Einige der anderen getesteten Substituentensind bekannt dafür, dass sie negative induktive oder mesomereEffekte ausüben, die in der Lage sind, die Elektronendichteim Imidazolring zu verringern, was auch zu schlechteren Bindungskonstantenbeiträgt. Die Unterschiede bei den Ki-Wertenvon L-Histidin und Histidinamid zeigen auch einen gewissen Einflussder Ladung auf die Bindung an. Der Nachweis für eine elektrostatischeAbstoßung der geladenen Substrate wurde bereits in denUntersuchungen zur Substratspezifität gezeigt, d. h. Glutaminamidwurde von humaner QC leicht zu Produkten umgewandelt, aber fürfreies Glutamin als Substrat wurde keine Reaktivität beobachtet.
C-2Derivate. Alle getesteten Derivate hemmten QC schwächerals Imidazol. Jede Substitution, die größer istals ein Proton, verhindert eine ordnungsgemäßeQC-Bindung. Allein aufgrund der Methylgruppe in 2-Methylbenzimidazolfällt die Hemmungskonstante um etwa eine Größenordnung.Eine sehr ähnliche Beziehung wurde gezeigt durch Vergleichder Ki-Werte für Benzimidazol und2-Aminobenzimidazol. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse,dass der Einfluss nicht mit elektronischen Änderungen verbundenist.
N-1Derivate. Unter den auf die Hemmung der humanen QC getesteten Imidazolderivatenzeigten die meisten Verbindungen, die einen verbesserten Ki-Werte im Vergleich zu Imidazol aufwiesen, Änderungenan einem Stickstoffatom. Diese Verbindungen enthielten auch einender wirksamsten QC-Inhibitoren, 1-Benzylimidazol. Interessant ist,dass nur kleine Änderungen dieser Struktur zu einem Verlustder hemmenden Qualität führten, wie man an 1-Benzoylimidazolund Phenylimidazol sehen kann, die unter den Versuchsbedingungen inaktivwaren. Auch in diesem Fall schienen die beobachteten Veränderungennicht nur durch eine verringerte Elektronendichte des Imidazolringsauf Grund des negativen mesomeren Effekts der Phenylgruppe verursacht zuwerden, weil auch die sperrige Trimethylsilylgruppe, die einen positiveninduktiven Effekt ausübt, eine verminderte Bindung im Vergleichzu anderen Resten zeigte. Interessanterweise war 1-Aminopropylimidazoleine der weniger wirksamen Verbindungen dieser Gruppe. Die geringe Wirksamkeitdieser Verbindung wird durch die basische Aminogruppe verursacht,da die sterisch ähnlichen Verbindungen 1-Methylimidazolund 1-Vinylimidazol eine verbesserte Bindung an das aktive Zentrumzeigten. Damit ist die positiv geladene Aminogruppe ursächlichfür den kleineren Ki-Wert, einErgebnis, das durch einen Vergleich der Ki-Wertevon N-ω-acetyliertem Histamin (Tabelle 3) und Histamin(Tabelle 4) bestätigt wird.
Effektder 3,4 und 3,5 Derivatisierung. Die Imidazolderivate, die Substituentenan Position 4(5) oder beiden enthielten, zeigten, dass sie eineeingeschränkte Effizienz für die Bindung an dasEnzym haben. Der Effekt der spezifischen Substitutionen wurde spezifiziertdurch Vergleich der Hemmungskonstanten von L-Histamin und den beidenZwischenprodukten beim biologischen Abbau von Histamin, 3-Methyl-4-Histaminund 3-Methyl-5-Histamin (Tabelle 4). L-Histamin offenbarte einenKi-Wert, der im Vergleich zu seinem acetylierten Gegenstücketwa um eine Größenordnung kleiner war. Die Methylierungvon einem Stickstoff führte zu einer erheblichen Verbesserungder Wirksamkeit im Fall von 3-Methyl-4-Histamin. Die zu 3-Methyl-5-Histaminführende Methylierung resultierte jedoch in einem völligenVerlust der inhibitorischen Aktivität. Somit scheint der beobachteteEffekt hauptsächlich auf eine sterische Hinderung der Bindungauf Grund der Derivatisierung des Kohlenstoffs neben dem basischenStickstoff zurück zu (ihren zu sein. Vermutlich spieltder basische Stickstoff eine Schlüsselrolle fürdie Bindung an das Enzym.
Beispiel 8: Bildung von Aβ3-40/42DerivatenDieMessungen wurden ausgeführt mit zwei kurzen N-terminalenPeptid-Sequenzen von Aβ3-40/42, [Gln3]-Aβ1-11(Sequenz: DAQFRHDSGYE) und [Gln3]Aβ3-11,die ein Glutamin an Stelle eines Glutaminsäurerestes ander dritten Position enthalten. Spaltung durch DP IV und Cyclisierungdes N-terminalen Glutaminrestes durch QC wurde bei den beiden Peptidendurch getestet unter Verwendung von MALDI-TOF Massenspektrometrie.Die Messungen wurden ausgeführt unter Verwendung von gereinigterDP IV (Schweineniere) oder rohem Homogenat der Schweinehypophyseals Quellen für QC sowie für beide Enzyme fürdie Messungen der konsekutiven Katalyse.
Ergebnisse1. Bildung von [Gln3]Aβ3-11aaus [Gln3]Aβ1-11a, katalysiertdurch DPIV, und deren Verhinderung durch den DP IV-Inhibitor Val-Pyrrolidid(Val-Pyrr)DPIV oder DP IV-ähnliche Aktivität spaltet [Gln3]Aβ1-11a unter Bildung von [Gln3]Aβ3-11a (7). Der Restan der dritten Position wird durch diese Spaltung freigelegt undwird dadurch für Modifikationen durch andere Enzyme, d.h. QC, zugänglich. Wie erwartet kann die Katalyse durchVal-Pyrr vollständig verhindert werden (8).
2. Bildung von [pGlu3]Aβ3-11aaus [Gln3]Aβ3-11a durch Katalysevon QC aus Hypophysenhomogenat und Verhinderung durch Val-Pyrr und1,10-PhenanthrolinGlutaminyl-Cyclase,die im Homogenat von Schweinehypophyse vorhanden ist, katalysiertdie Umwandlung von [Gln3]Aβ3-11azu [pGlu3]Aβ3-11a (9).Bildung von [pGlu3]Aβ3-11a wurdegehemmt durch Zugabe von 1,10-Phenanthrolin (10).
3. Konsekutive Katalyse von DP IV undQC, resultierend in der Bildung von [pGlu3]Aβ3-11aund Verhinderung durch Val-Pyrr und 1,10-PhenanthrolinBildungvon [pGlu3]Aβ3-11a aus [Gln3]Aβ3-11a findet statt nach konsekutiverKatalyse durch DP IV und QC, gemessen in Rohhomogenat von Schweinehypophysemit zugesetzter DP IV aus Schweineniere (11). [pGlu3]Aβ3-11a wurde nicht gebildet,wenn der QC-Inhibitor 1,10-Phenanthrolin (12) oderder DP IV-Inhibitor Val-Pyrr zugefügt wurde (13).Die leichte Erscheinung von [pGlu3]Aβ3-11aist zurück zu führen auf eine Aminopeptidasespaltungund die folgende Cyclisierung des Glutaminrestes, auch angezeigt durchdie Bildung von [Gln3]Aβ2-11a.
4. Bildung von [pGlu3]Aβ3-11ain rohem Hypophysenhomogenat durch Katalyse von Aminopeptidase(n)AufGrund der Bildung von [pGlu3]Aβ3-11a,die nicht von DP IV Katalyse abhängig war, wurde der Abbauvon [Gln3]Aβ1-11a untersucht inrohem Hypophysenhomogenat ohne Zusatz von DP IV (14).Wie aus den Daten in Abschnitt 4 erwartet, wurde die Bildung von[pGlu3]Aβ3-11a beobachtet. DieDaten zeigen, dass der Abbau von [Gln3]Aβ1-11aauch durch Aminopeptidase(n) katalysiert werden kann, resultierendin [pGlu3]Aβ3-11a. Damit zeigendie Ergebnisse, dass die Pyroglutamylbildung ein Endpunkt des N-terminalen Peptidabbausin diesem Gewebe ist, was die Rolle von QC bei der Plaquebildungweiter stützt.
Beispiel 9: Umsatz von [Gln3]Aβ3-11a;3-21a und 3-40 durch rekombinante humane QCAllegetesteten [Gln3]Aβ-abgeleitetenPeptides wurden durch humane QC effizient in die entsprechendenPyroglutamatylformen umgewandelt (Tabelle 8). Auf Grund der schlechtenLöslichkeit von [Gln3]Aβ3-21a und[Gln3]Aβ3-40 in wässrigerLösung wurden die Bestimmungen in der Gegenwart von 1%DMSO ausgeführt. Die bessere Löslichkeit von [Gln3]Aβ3-11a erlaubte jedoch eine kinetischeAnalyse des QC-katalysierten Umsatzes in Gegenwart und Abwesenheitvon DMSO (Tabelle 8). Zusammengefasst, die Untersuchung der Aβ Peptideals QC-Substrate mit einer Kettenlänge von 8, 18 und 37Aminosäuren (siehe Tabelle 8) bestätigte die Beobachtung,dass humane QC-Aktivität mit der Länge seinerSubstrate zunimmt. Dementsprechend sind Gln1-Gastrin,Gln1-Neurotensin, Gln1-GnRHunter den besten QC-Substraten, wenn man die Spezifitätskonstantenberücksichtigt. Ähnlich zeigten [Gln3]Aβ3-40und Glucagon, die bisher größten untersuchtenQC-Substrate, hohe Geschwindigkeitskonstanten 2. Ordnung (449 mM–1s–1 bzw.526 mM–1s–1),sogar in Anwesenheit von 1% DMSO (Tabelle 8).
Interessanterweise ändertensich die kinetischen Parameter für die Umwandlung der untersuchten Amyloid-Peptide mit zunehmender Größe nicht dramatisch,was darauf hindeutet, dass der C-terminale Teil von Aβ nurmoderate Auswirkungen auf die QC Katalyse hat. Wegen der besserenLöslichkeit und experimentellen Handhabbarkeit wurden daherdie weiteren Untersuchungen bezüglich der Prozessierungdurch N-terminale Aminopeptidasen unter Verwendung der kleinerenFragmente von Aβ, [Gln3]Aβ1-11a,[Gln3]Aβ3-11a und Aβ3-11a,durchgeführt. Tabelle 8: Kinetische Parameter fürdie Umwandlung von N-terminal Gln-enthaltenden Peptiden durch rekombinantehumane QC in Pufferlösung, enthaltend 1% DMSOPeptidKM (μM)kcat (s–1)kcat/KM (mM–1s–1)[Gln3]Aβ3-11a87 ± 3#55 ± 1#632 ± 10#[Gln3]Aβ3-11a155 ± 441,4 ± 0,4267 ± 4[Gln3]Aβ1-21a162 ± 1262 ± 3383 ± 10[Gln3]Aβ3-4089 ± 1040 ± 2449 ± 28Glucagon(3-29)19 ± 110,0 ± 0,2526 ± 17# bestimmt in Abwesenheit von DMSO
Beispiel 10: Umsatz von Aβ3-11aund Aβ3-21a durch rekombinante humane QCDieInkubation von Aβ3-11a und Aβ3-21a in Gegenwartvon QC ergab, dass im Gegensatz zu früheren Arbeiten, Glutamat-haltigePeptide auch als QC-Substrate dienen können (15C und D). Die QC-katalysierte Bildungvon [pGlu3]Aβ3-11a und [Gln3]Aβ3-21a wurde untersucht bei pH5,2 bzw. 6,5. Wenn der QC-Inhibitor Benzimidazol vor dem Start desAssays durch Zugabe von QC zu der Lösung zugegeben wurde,wurde die Substratumwandlung, die zu [Gln3]Aβ3-11aoder [Gln3]Aβ3-21a führt,unterdrückt (15E und F).Wenn QC vor der Zugabe gekocht wurde, war die Bildung der pGlu-Peptidevernachlässigbar (15A undB).
Beispiel 11: pH-Abhängigkeitder Papaya QC-katalysierten Cyclisierung von Gln-βNA undGlu-βNAPapayaQC wandelte Glu-βNA in einem Konzentrationsbereich biszu 2 mM (was durch die Löslichkeit des Substrats begrenztwar) gemäß Michaelis-Menten Kinetik um (16).Die Prüfung der Umsatz versus Substratkonzentration Diagrammefür die QC-katalysierte Umwandlung von Glu-βNA,untersucht zwischen pH 6,1 und 8,5, ergab, dass sich fürdieses Glu-Substrat beide Parameter, KM undkcat, in einer pH-abhängigen Art undWeise änderten (16). Diessteht im Gegensatz zu der vorher beschriebenen QC-katalysiertenCyclisierung von Glutamin, für die nur Änderungenbei KM über den angegebenen pH-Bereichbeobachtet wurden (Gololobov, M. Y., Song, I., Wang, W.und Bateman, R. C. (1994) Arch Biochem Biophys 309, 300-307).
Anschließendwurde die pH-Abhängigkeit der Cyclisierung von Glu-βNAund Gln-βNA unter Bedingungen von Geschwindigkeitsraten1. Ordnung (d. h. Substratkonzentrationen weit unterhalb KM-Werten) untersucht, um den Einfluss derProtonenkonzentration während der Glu- und Gln-Cyclisierungzu studieren (17). Die Cyclisierung von Glutaminhat ein pH-Optimum bei pH 8,0, im Gegensatz zu der Cyclisierungder Glutaminsäure, die ein pH-Optimum von pH 6,0 zeigte.Während sich die Spezifitätskonstanten bei denjeweiligen pH-Optima etwa 80000-fach unterscheiden, ist das Verhältnisvon QC- versus EC-Aktivität um pH 6,0 nur etwa 8000.
Dienicht-enzymatische pGlu-Bildung aus Gln-βNA, untersuchtbei pH 6,0, wurde für 4 Wochen verfolgt und ergab eineGeschwindigkeitskonstante 1. Ordnung von 1,2·10–7s–1.Jedoch wurde während dieses Zeitintervalls kein pGlu-βNAaus Glu-βNA gebildet, was erlaubt, die Geschwindigkeitskonstantefür den Umsatz auf 1,0·10–9s–1 zu schätzen.
Beispiel 12: Enzyminaktivierungs-/-reaktivierungsverfahrenEinAliquot der humanen QC (0,1–0,5 mg, 1 mg/ml) wurde überNacht inaktiviert durch Dialyse gegen einen 3000-fachen Überschussvon 5 mM 1,10-Phenanthrolin oder 5 mM Dipicolinsäure in0,05 M Bis-Tris/HCl, pH 6,8. Anschließend wurde das Inaktivierungsmittelsorgfältig entfernt durch Dialyse (3 Zyklen, 2000-fachen Überschuss)der Proben gegen 0,05 M Bis-Tris/HCl, pH 6,8, enthaltend 1 mM EDTA.Reaktivierungsexperimente wurden 15 Minuten lang durchgeführtbei Raumtemperatur unter Verwendung von Zn++,Mn++, Ni++, Ca++, K+ und Co++ Ionenin Konzentrationen von 1,0, 0,5, 0,25 mM in 0,025 M Bis-Tris, pH6,8, enthaltend 0,5 mM EDTA. QC-Aktivitätsassays wurdendurchgeführt in 0,05 M Tris/HCl, pH 8,0, enthaltend 2 mMEDTA, um eine schnelle Reaktivierung durch Metallionen, in Spurenin Pufferlösungen vorhanden, zu vermeiden.
DieHemmung von Schweine QC durch 1,10-Phenanthrolin wurde bereits beschrieben(Busby, W. H. J. et al. 1987 J Biol Chem 262, 8532-8536, Bateman,R. C. J. et al. 2001 Biochemistry 40). Die Tatsache, dass fürEDTA gezeigt worden, das es eine aktivierende Wirkung auf die QC-Katalysehat, legte jedoch nahe, dass die Hemmung durch Phenanthrolin nichtauf eine Chelatisierung des Metalls zurück zu führenist (Busby, W. H. J. et al. 1987 J Biol Chem 262, 8532-8536, Bateman,R. C. J. et al. 2001 Biochemistry 40). Zusätzlichzu der Hemmung durch 1,10-Phenanthrolin wurde die von humaner QCkatalysierte Substratcyclisierung auch in Gegenwart von Dipicolinsäureund 8-Hydroxychinolin, anderen Inhibitoren von Metalloenzymen, verhindert. DieseChelatoren hemmen QC in einer kompetitiven und zeitabhängigenWeise, d. h. es wurde gefunden, dass bereits anfänglichkompetitiv gehemmte Aktivität nach längerer Inkubationmit den Verbindungen weiter verringert wird (18, 19).Interessanterweise zeigte EDTA unter keinen Bedingungen eine merklicheHemmung, unabhängig von der Inkubationszeit.
HumaneQC wurde nach umfangreicher Dialyse gegen 5 mM 1,10-Phenanthrolinoder 5 mM Dipicolinsäure fast vollständig inaktiviert.Nach wiederholter Dialyse über Nacht gegen Chelator-freiePufferlösungen, wurde die QC-Aktivität teilweisereaktiviert, bis zu 50 bis 60%. Wenn jedoch gegen Puffer, enthaltend1 mM EDTA, dialysiert wurde, wurde keine Reaktivierung beobachtet.
Nahezuvollständige Wiederherstellung der QC-Aktivitätnach Inaktivierung mit entweder Dipicolinsäure oder 1,10-Phenanthrolinwurde erreicht durch 10 minütige Inkubation des Proteinmit 0,5 mM ZnSO4 in Gegenwart von 0,5 mMEDTA (20). Teilweise Wiederherstellungder QC-Aktivität wurde gleichermaßen bei Verwendungvon Co++- und Mn++-Ionenfür die Reaktivierung erreicht. Selbst in Gegenwart von0,25 mM Zn++ war eine Reaktivierung biszu 25% der ursprünglichen Aktivität möglich.Keine Reaktivierung wurde beobachtet bei Anwendung von Ni++-, Ca++-oder K+-Ionen. Ebenso hatte die Inkubationvon vollständig aktiver QC mit diesen Ionen keinen Effektauf die Enzymaktivität.
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